Summary
Para cultivar células-tronco da crista neural (NCSC) in vitro, um meio especial (NCSCM) é necessária. Parte essencial da NCSCM é extrair pinto embrião (CEE). Nós aqui descrever as técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE, incluindo detalhes como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos.
Abstract
A crista neural surge a partir da neuro-ectoderma durante a embriogênese e persiste apenas temporariamente. Os primeiros experimentos já corrigido células progenitoras pluripotentes a ser parte integrante da crista neural 1. Fenotipicamente, as células-tronco da crista neural (NCSC) são definidos por, simultaneamente, expressando p75 (low-affine nervo receptor do fator de crescimento, LNGFR) e SOX10 durante a sua migração da crista neural 2,3,4,5. Estas células progenitoras podem se diferenciar em células musculares lisas, células cromafins, neurônios e células gliais, bem como a cartilagem melanócitos e osso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, um especial da crista neural meio de células-tronco (NCSCM) é necessária 10. A parte mais complexa do NCSCM é a preparação de extrato de pinto embrião (CEE), que representa uma fonte essencial de fatores de crescimento para o NCSC, bem como para outros tipos de explantes neural. Outros ingredientes NCSCM lado CEE estão disponíveis comercialmente. Produzindo CCE usando equipamentos de laboratório padrão é de grande importância para saber sobre os detalhes desafiador como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos. Neste protocolo, descrevemos técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE.
Protocol
Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha).
Parte 1: Configurando (não mostrado no vídeo)
PREPARAÇÃO DE MATERIAIS E SOLUÇÕES (antes de tomar os ovos da incubadora)
- Os ovos devem ser incubados em incubadora umidificada por 11 dias a 37 ° C (100 ° F).
- Spray de etanol 70%, placas limpas, precisas pinças limpas, 4 ° C (40 ° F) DMEM estéril frio no gelo e 60 mL seringas esterilizadas
- 50 mL tubos estéreis corning têm de ser half-filled com 4 ° C frio DMEM para misturar os embriões macerados em uma proporção de 1:1 (massa maceradas: DMEM). Assim que os ovos são retirados da dissecção da incubadora embriões de galinha tem que ser iniciado.
- Esterilizar instrumentos de dissecação em autoclave ou no dia da dissecção, mergulhe as ferramentas em etanol 70% por 20 minutos.
Parte 2: Dissecção da embriões de galinha (demonstrado no vídeo)
- Wet os ovos incubados com um spray de etanol 70% por pelo menos 30 segundos e seque-os cuidadosamente com toalhas de papel macio limpo, enquanto não apertar os ovos em excesso.
Nota: Recomendamos não dissecar mais de 60 embriões de galinha simultaneamente. - Abra os ovos com cuidado com o rápido contra uma borda afiada e retirar o embrião com cuidado de não destruir o saco vitelino ou o embrião de galinha em si.
- Pesquisa para o início do cordão umbilical de forma rápida e abrir o embrulho clara, sem destruir o saco vitelino ou qualquer vasinhos. Então dissecar o cordão umbilical com uma pinça precisa limpar.
- Leve o embrião fora do saco vitelino.
Nota: Os embriões devem ser decapitado rapidamente (não mostrado no vídeo). - Coletar os embriões em meio essencial mínimo a 4 ° C.
Parte 3: maceração do embriões de galinha
- Pegue o êmbolo de uma seringa de 60 ml estéril.
- Transferência de cerca de 10 embriões em uma seringa de 60 mL.
- Coloque o êmbolo com cuidado para a seringa para não arriscar perder o material macerado.
- Macerar empurrando o êmbolo.
- Coletar a massa maceradas nos tubos preparados corning half-filled com DMEM, na proporção de 1:1 (massa maceradas: DMEM). Usando 10 embriões um volume de aproximadamente 25 mL é produzido.
- Coloque a mistura em um agitador por 45 min a 4 ° C.
Parte 4: A centrifugação do embrião de galinha - Suspensão DMEM
- Transferir o embrião de galinha - suspensão DMEM nos tubos de centrifugação.
- Adicionar hialuronidase estéril a uma concentração de 1 mg por 25 mg de embrião.
- Tara os tubos de centrifugação com muita precisão.
Nota: Esta etapa deve ser realizada com cautela, de centrifugação é executado em alta g-force e danos materiais ou centrífuga poderia ocorrer se usar tubos de desequilibrado. Com alta precisão de acordo com peso do equipamento, quanto as três posições após o ponto decimal para todos os tubos devem ser recebidos, ajustando o montante em falta com DMEM. - Reduzir a temperatura da centrífuga a 4 ° C.
Nota: Além disso, o rotor de centrifugação deve ser armazenado em uma câmara de refrigeração ou geladeira durante a noite. - Centrífuga 6 horas pelo menos para 180,000 xgx h. Nota: Para resultados superiores em relação à separação das fases de uso único 266,000 xgx h. Se possível, use o ajuste de vácuo.
Parte 5: Filtração do Extrato de embrião de galinha
Após a centrifugação, três fases podem ser notados: A fase líquida superior dingy com fragmentos de gordura, a fase de líquidos claros no meio e do sedimento no fundo do tubo de centrifugação. Nota: vibração ou movimento rápido da mistura centrifugada tem que ser evitado, pois isso destruiria o resultado da etapa de centrifugação por perder a fase de líquido claro central.
Nota: Todos os seguintes passos devem ser realizados em condições estéreis usando um fluxo de ar laminar de bancada:
- Pipeta a fase clara líquido em um sistema de filtro com poros de 0,45 mM. Em seguida, ligue a bomba de vácuo conectada.
Nota: Não toque na pelota no fundo. Isso levaria a uma contaminação do extrato e um bloqueio do sistema de filtragem. - Transfira o extrato de pré-em um sistema de filtro com poros de 0,22 mm e ligar a bomba de vácuo ligada novamente.
- Alíquota do extrato do embrião atingido pintoestéril em tubos de 15 mL corning.
- Armazenar rapidamente as alíquotas a -80 ° C (-62 ° F). Nota: A CEE durar até dois anos se armazenado a -80 ° C.
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Discussion
Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritas 10,11 no passado. Além de publicações antigas que aqui mostram os passos individuais diferentes do processo mais expandida. Isto suporta o experimentador com detalhes importantes assegurando corretos procedimentos e resultados confiáveis. Além disso, como o processo de dissecção é uma parte essencial de extração CEE descrevemos o procedimento de tomar os embriões fora do saco vitelino em cada detalhe. Há vários pontos importantes a considerar como discutido abaixo.
A dissecção da embriões de galinha deve ser iniciado o mais rapidamente possível após a incubação terminou. Embriões mortos antes da dissecção não deve ser usado para todas as etapas deste protocolo como ativação enzimática e degradação de proteínas podem influenciar negativamente o resultado.
Antes de começar alguma mão-de treinamento deve ser realizado como todas as etapas do processo de dissecção tem que ser realizado com rapidez e precisão. É importante para o sucesso de todo o processo, para evitar a contaminação com gema de ovo que foi acompanhado por uma quantidade notável de proteínas negativamente interferir. Depois os embriões foram retirados dos sacos gema devem ser decapitado rapidamente (não mostrado no vídeo).
Temperatura, bem como a celeridade do rotor são muito importantes, também. A fim de evitar a ativação enzimática e uma redução da qualidade e quantidade dos fatores necessários para o NCSCM a temperatura da centrífuga eo rotor deve ser reduzida para 4 ° C. Após a etapa de centrifugação, a fase líquida clara central é o extrato de pré-importante, que contém os fatores de crescimento essenciais para a NCSCM. Para uma separação considerável das diferentes frações e um enriquecimento dos fatores necessários recomendamos não uma celeridade inferior 180,000 xgx h.
Como a diferença de densidade entre a fase clara líquido ea fase líquida dingy no topo do tubo de centrifugação não impede que um remix das duas partes qualquer agitação tem de ser evitado. Os componentes da fase líquida dingy não pode ser filtrada através de um sistema M 0,45 filtro, como as partes gordas do que seria muito em breve, levar à obstrução do sistema de filtro. Também a pelota no fundo da centrífuga não deve ser tocado em todos, como partes de que iria levar ao entupimento do sistema de filtro.
Em uma etapa final o potencial da CEE para o cultivo de NCSCs tem de ser validado. Esta população multipotentes transitória de células-tronco perde sua viabilidade rapidamente na mídia sem ter adicionado adequada CEE produzido. Portanto, uma linha de camundongo transgênico (JoMa1), que expressa primeiros marcadores NCSC de forma transgene dependente de atividade e é usado para estudar biologia NCSC é cultivada em todos os recém-obtidas de carga CEE 10. O cultivo de sucesso NCSCs representa uma validação adequada da CEE.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O apoio e aconselhamento de Markus Pajtler Bohrer e Robert foram inestimáveis para a visualização deste protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
