Summary
Att odla neurala celler crest stamceller (NCSC) in vitro, är ett speciellt medium (NCSCM) krävs. Viktig del av NCSCM är kycklingembryo extrakt (CEE). Vi beskriver här exakta tekniker för att producera en maximal mängd av ren och hög kvalitet CEE, däribland detaljer isolering, maceration, centrifugering och filtrering.
Abstract
Den neurallist beror på neuro-ektoderm under fosterutvecklingen och kvarstår bara tillfälligt. Tidiga experiment säkras redan pluripotenta stamceller som en integrerad del av neural crest 1. Fenotypiskt är neurallist stamceller (NCSC) definieras genom att samtidigt uttrycka p75 (låg-affina nervtillväxtfaktor receptorn, LNGFR) och SOX10 under sin migration från neural crest 2,3,4,5. Dessa stamceller kan differentiera till glatta muskelceller, chromaffin celler, nervceller och gliaceller, liksom melanocyter, brosk och ben 6,7,8,9. Att odla NCSC in vitro, en speciell neural crest stamceller medium (NCSCM) krävs 10. Den mest komplexa delen av NCSCM är beredningen av kycklingembryo extrakt (CEE) som representerar en viktig källa till tillväxt faktorer för NCSC liksom för andra typer av neurala explants. Andra NCSCM ingredienser bredvid CEE finns kommersiellt tillgängliga. Producera CCE använda laboratorieutrustning standardutrustning är det av stor vikt att veta om de utmanande uppgifter som isolering, maceration, centrifugering och filtrering. I detta protokoll beskriver vi exakt tekniker för att producera en maximal mängd av ren och hög kvalitet CEE.
Protocol
Författarna hävdar att experiment på djur har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv (86/609/EEG) i enlighet med riktlinjerna av NIH angående skötsel och användning av djur för försöksändamål förfaranden och de regler som anges av Institutional Animal Skötsel och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Duisburg-Essen (Tyskland).
Del 1: Installera (visas inte på Video)
FÖRBEREDA material och lösningar (innan man tar äggen ur inkubatorn)
- Ägg måste inkuberas i en fuktig kuvös i 11 dagar vid 37 ° C (100 ° F).
- 70% etanol spray, rena tallrikar, exakt ren pincett, 4 ° C (40 ° F) kallt sterilt DMEM på is och 60 ml sterila sprutor
- 50 ml sterilt Corning rören måste vara halv-fylld med 4 ° C kallt DMEM att blanda urlakade embryon i förhållandet 1:1 (urlakade massa: DMEM). Så fort äggen tas ut ur kuvösen dissekering av kycklingembryon måste startas.
- Sterilisera dissektion verktyg i autoklaven eller på dagen för dissektion, sänk de verktyg som i 70% etanol i 20 minuter.
Del 2: dissekering av kycklingembryon (vilket visats på Video)
- Blöt ruvade ägg med 70% etanol spraya i minst 30 sekunder och torka dem noga med rent mjukt hushållspapper utan att skaka äggen överdrivet.
Obs: Vi rekommenderar inte dissekera mer än 60 kycklingembryon samtidigt. - Öppna äggen försiktigt rusa mot en skarp kant och ta ut ett embryo med försiktighet inte förstöra äggulan säck eller kycklingembryo själv.
- Sök början av navelsträngen snabbt och öppna tydliga förpackningen utan att förstöra äggulan säck eller något litet fartyg. Sedan dissekera navelsträngen med exakt ren pincett.
- Ta embryot ur gulan säcken.
OBS: Embryon bör halshuggas snabbt (visas inte i videon). - Samla embryon i minimala väsentligt på 4 ° C.
Del 3: malning av kycklingembryon
- Ta kolven ur en 60 ml steril spruta.
- Överför ca 10 embryon till en 60 ml spruta.
- Sätt kolven försiktigt tillbaka i sprutan för att inte riskera att förlora urlakade materialet.
- Upplösta genom att trycka ned kolven.
- Samla urlakade massan i den förberedda Corning rören till hälften fylld med DMEM i förhållandet 1:1 (urlakade massa: DMEM). Använda 10 embryon en volym på cirka 25 mL produceras.
- Lägg blandningen på en shaker i 45 minuter vid 4 ° C.
Del 4: centrifugering av Chick Embryo - DMEM Fjädring
- Överför kycklingembryo - DMEM suspensionen i centrifugering rören.
- Tillsätt steril hyaluronidas vid en koncentration av 1 mg per 25 mg embryot.
- Tare centrifugeringen rören mycket exakt.
OBS: Detta steg ska utföras med försiktighet eftersom centrifugering körs i mycket höga g-kraft och skador på material eller centrifug kan inträffa om du använder obalanserade rör. Med en hög noggrannhet väger maskinen enligt beträffande de tre positionerna efter decimalkomma för alla rör ska tas emot genom att justera den saknade beloppet med DMEM. - Sänk temperaturen i centrifugen till 4 ° C.
OBS: Även centrifugeringen rotorn bör förvaras i en kyl kammare eller kyl över natten. - Centrifugera 6 timmar åtminstone för 180,000 xgx h. Obs: För bättre resultat om separationen av de enskilda faserna använda 266,000 xgx h. Om möjligt, använd det vakuum justering.
Del 5: Filtrering av Chick Embryo Extract
Efter centrifugering kan tre faser märkas: Den övre grådaskig flytande fasen med feta fragment, den klara vätskefasen i mitten och pellets på botten av centrifugering röret. OBS: skaka eller rask förflyttning av centrifugeras blandningen måste absolut undvikas, eftersom detta skulle förstöra resultatet av centrifugering steg för att förlora den klara centrala vätskefasen.
Notera: Alla följande steg måste utföras under sterila förhållanden med hjälp av ett laminärt bänk luftflöde:
- Pipettera den klara vätskefasen i ett filtersystem med porer på 0,45 ìm. Slå sedan på den anslutna vakuumpump.
OBS: Rör inte pellets på botten. Detta skulle leda till en förorening av extrakt och en blockering av filtersystem. - Överför före extraktet till ett filtersystem med porer på 0,22 ìm och slå på den anslutna vakuumpump igen.
- Alikvotera uppnådd kycklingembryo extrakti steril 15 ml Corning rör.
- Snabbt lagra alikvoter vid -80 ° C (-62 ° F). Obs: CEE varar upp till två år om den förvaras vid -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är baserad på modifieringar av förfaranden som har beskrivits tidigare 10,11. Förutom tidigare publikationer visar vi här den enskilde olika stegen i processen utvidgats. Detta stöder försöksledaren med viktiga detaljer säkerställa korrekta förfarandet och pålitliga resultat. Vidare, eftersom dissektion processen är en viktig del av CEE utvinning vi beskriver förfarandet för att ta embryon ur gulan säck i varje detalj. Det finns flera viktiga punkter att notera som diskuteras nedan.
Dissekering av de kycklingembryon bör påbörjas så snart som möjligt efter inkubation har upphört. Embryon att vara död före dissektion bör inte användas för några åtgärder i detta protokoll som enzymatisk aktivering och proteinnedbrytning kan påverka resultatet negativt.
Innan du börjar lite hand om utbildning bör utföras som alla steg i dissekering processen måste genomföras snabbt och exakt. Det är viktigt för framgång av hela förfarandet, att undvika kontaminering med äggula som åtföljdes av en anmärkningsvärd mängd negativt störande proteiner. Efter att embryon har tagits ur äggulan säckar de bör halshuggas snabbt (visas inte i videon).
Temperatur samt snabbhet av rotorn är mycket viktiga också. För att undvika enzymatisk aktivering och en minskning av kvalitet och kvantitet av de faktorer som behövs för NCSCM temperaturen i centrifugen och rotorn bör minskas till 4 ° C. Efter centrifugeringssteget den klara centrala vätskefasen är det viktiga pre-extrakt som innehåller de viktigaste tillväxtfaktorerna för NCSCM. För att uppnå en betydande separation av olika fraktioner och en anrikning av de faktorer som behövs rekommenderar vi en hastighet som inte understiger 180,000 xgx h.
Som skillnaden i densitet mellan den klara vätskefasen och grådaskig vätskefasen vid toppen av centrifugering röret inte hindrar en mixning av två delar, en skakande måste undvikas. Komponenterna i smutsiga vätskefasen kan inte filtreras genom ett 0,45 ìm filtersystem, som den feta delar av det skulle mycket snart leda till igensättning av filter systemet. Även pellets i botten av centrifugen bör inte vidröras alls, som delar av det skulle leda till igensättning av filter systemet.
I ett sista steg potentialen i CEE för odling av NCSCs måste valideras. Detta multipotenta övergående population av stamceller förlorar sin livskraft snabbt i media utan att behöva läggas tillräcklig produceras CEE. Därför är en transgen mus linje (JoMa1), som uttrycker tidigt NCSC markörer i en transgen-aktivitet beroende sätt och används för att studera NCSC biologi odlas i varje nyligen fått ansvar för CEE 10. Den framgångsrika odlingen av NCSCs representerar en lämplig validering av CEE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Stöd och råd av Markus Pajtler och Robert Bohrer var ovärderliga för visualisering av detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
