Summary
In vitro nöral krest kök hücreler (NCSC) yetiştirmek için özel bir orta (NCSCM) gereklidir. NCSCM önemli bir parçası civciv embriyo ekstraktı (CEE). Biz burada, izolasyon, maserasyon, santrifüj ve filtrasyon işlemleri gibi ayrıntıları da dahil olmak üzere saf ve kaliteli CEE maksimize miktarda üretmek için doğru teknikleri anlatıyoruz.
Abstract
Nöro-ektoderm nöral krest embriyogenez sırasında ortaya çıkan ve sadece geçici bir süre devam. İlk deneyler zaten nöral krest 1 ayrılmaz bir parçası olmak pluripotent progenitör hücrelerin geçirmez. Fenotipik, nöral krest kök hücreler (NCSC) nöral krest 2,3,4,5 göç sırasında aynı anda P75 (düşük afin sinir büyüme faktörü reseptörü LNGFR) ve SOX10 ifade ile tanımlanır . Bu progenitör hücreler, düz kas hücreleri, kromafin hücreler nöronlar ve glial hücrelerin yanı sıra, melanosit, kıkırdak ve kemik 6,7,8,9 ayırt edebilirsiniz . 10 in vitro, özel nöral krest kök hücre orta (NCSCM) NCSC yetiştirmek için gereklidir. NCSCM en karmaşık parçası NCSC yanı sıra, sinir eksplant diğer türleri için büyüme faktörlerinin önemli bir kaynağı temsil civciv embriyo ekstraktı (CEE) hazırlanması. CEE yanında diğer NCSCM maddeler ticari olarak kullanılabilir. Izolasyon, maserasyon, santrifüj ve filtrasyon işlemleri gibi zorlu detayları hakkında bilmek büyük önem CCE kullanarak laboratuvarda standart ekipman üretimi. Bu protokolde, saf ve yüksek kaliteli CEE maksimize miktarda üretmek için doğru teknikleri anlatıyoruz.
Protocol
Hayvanlar üzerinde yapılan deneylerde, hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili deneysel prosedürleri ve Kurumsal Hayvan tarafından belirlenen düzenlemelere NIH Rehberi ardından, Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi (86/609/EEC) uygun olarak yapıldığını ve bu yazarlar Bakım ve Duisburg-Essen Üniversitesi (Almanya) Komitesi (IACUC) kullanın.
Bölüm 1: Kurma (Video gösterilir)
GEREÇ VE ÇÖZÜMLER HAZIRLAMA (kuluçka yumurta alarak önce)
- Yumurta nemlendirilmiş bir inkübatör 37 az 11 gün inkübe olması ° C (100 ° F).
- % 70 etanol sprey, temiz plakaları, hassas, temiz forseps, 4 ° C (40 ° F) soğuk steril buz DMEM ve 60 ml steril şırıngalar
- 50 ml Steril Corning tüpler 4 ° C soğuk DMEM 1:1 oranında (DMEM yumuşatılır kitle) elma sirkesine embriyolarının karışımı ile yarım dolu olması. , Yumurta, civciv embriyo inkübatör diseksiyon dışarı alınır gibi kısa sürede başlatılmalıdır.
- Diseksiyon araçları sterilize otoklav veya diseksiyon gün, 20 dakika boyunca% 70 etanol araçları bırakın.
Bölüm 2: Civciv Embriyolar Diseksiyon (Video gösterdiği)
- En az 30 saniye boyunca% 70 etanol sprey ile inkübe yumurta Islak ve aşırı yumurta sallayarak olmasa da temiz yumuşak kağıt havlu ile iyice kurulayın.
Not: Aynı anda 60'dan fazla civciv embriyolarının diseksiyon değil tavsiye ederiz . - Keskin bir kenarına şık dikkatlice açın ve yumurta sarısı çuval ya da civciv embriyo kendisi yok dikkatli embriyo.
- Göbek kordonu hızla başında arayın ve sarısı çuval ya da herhangi bir küçük damarları tahrip etmeden net bir sarma açık. Sonra kesin temiz forseps ile göbek kordonu teşrih.
- Yumurta sarısı çuval embriyo dışarı atın.
Not: Embriyolar (video gösterilmez) hızlı dekapite içinde olmalıdır . - 4 asgari temel orta embriyoların toplayın ° C
Bölüm 3: Civciv Embriyolar Maserasyon
- 60 ml steril enjektör pistonu atın.
- Biri 60 ml şırınga içine yaklaşık 10 embriyo transferine.
- Pistonu elma sirkesine malzeme kaybetme riskine girmemek için şırıngaya dikkatle geri koyun.
- Pistonu aşağı iterek ıslatarak yumuşatmak.
- Hazırlanan Corning tüpler 1:1 (: DMEM yumuşatılır kitle) bir oranında DMEM ile yarı dolu elma sirkesine kitle toplayın. 10 embriyolar yaklaşık 25 ml hacmi kullanılarak üretilir.
- 45 dakika 4 ° C için çalkalayıcı karışımı yerleştirin.
Bölüm 4: Civciv Embriyo Santrifüj - DMEM Süspansiyon
- Civciv embriyo transferi - DMEM süspansiyon santrifüj tüplerine.
- Embriyo başına 25 mg 1 mg konsantrasyonda steril hiyalüronidaz ekleyin.
- Çok hassas Dara santrifüj tüpleri.
Not: Bu adım çok yüksek g-kuvveti ve malzeme ya da dengesiz tüpler kullanılarak, santrifüj oluşabilir zarar santrifüj çalıştırmak gibi dikkatli yapılmalıdır. Yüksek doğruluk ile ilgili makine uygun DMEM ile kayıp miktarını ayarlayarak tarafından alınan tüm tüpler için ondalık noktadan sonra üç pozisyonda ağırlığındaki. - - 4 ° C santrifüj sıcaklığı azaltın
Not: Ayrıca santrifüj rotor gece boyunca soğutma oda ya da buzdolabında saklanan olmalıdır . - En az 180.000 xgx saat 6 saat Santrifüj Not: tek faz ayrılması konusunda üstün sonuçlar için 266.000 xgx h. Mümkünse, vakum ayarı kullanın.
Bölüm 5: Civciv Embriyo Özü Filtrasyon
Santrifüj sonra, üç aşamadan fark edilebilir: yağ parçaları, ortasında berrak sıvı faz ve santrifüj tüpünün dibinde pelet ile üst pis sıvı faz Not: Titreme veya tempolu santrifüje karışım hareket Bu merkezi berrak sıvı faz kaybederek, santrifüj adım sonucu yok olduğu gibi kesinlikle kaçınılmalıdır.
Not: Tüm aşağıdaki adımları laminer hava akışı tezgah kullanarak steril koşullar altında yapılması gereken:
- 0.45 mikron gözenekli bir filtre sistemi içine berrak sıvı faz Pipet. Sonra bağlı vakum pompası geçin.
Not: altta pelet dokunmayın. Bu, özü ve filtre sistemi bir tıkanma kontaminasyona yol açacak. - 0.22 mikron ve bağlı vakum pompası anahtarı tekrar gözenekli bir filtre sistemi içine ön-özü aktarın.
- Kısım elde civciv embriyo ekstresisteril 15 ml Corning tüpler.
- Hızla -80 alikotları saklamak ° C (-62 ° F). Not: -80 saklandığı takdirde iki yıla kadar son CEE ° C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, geçmişte 10,11 tarif edilmiştir prosedürlerin değişiklikler dayanmaktadır . Eski yayınların yanı sıra burada bireysel farklı sürecinin adımları daha genişletilmiş göstermektedir. Bu, doğru davası ve güvenilir sonuçlar sağlayan önemli detayları ile deneyi destekler. Ayrıca, diseksiyon sürecinin vazgeçilmez bir parçası CEE çıkarma gibi biz her detayında sarısı çuval embriyoların yaptırmayı prosedürü açıklar. Aşağıda anlatıldığı gibi Unutulmaması gereken birkaç önemli nokta vardır.
Civciv embriyolarının diseksiyonu inkübasyon sona erdikten sonra en kısa sürede başlanmalıdır. Diseksiyon önce ölü Embriyolar sonucu olumsuz etkileyebilecek herhangi bir adım enzimatik aktivasyonu ve protein parçalanması gibi bu protokol için kullanılmamalıdır.
Başlamadan önce bazı el ile ilgili eğitim, hızlı ve doğru bir şekilde yapılmalıdır diseksiyon sürecinin tüm adımları olarak yapılmalıdır. Bu, kayda değer bir olumsuz müdahale proteinlerin miktarı ile eşlik etti yumurta sarısı ile kirlenmesini önlemek için, bütün prosedürün başarısı için önemlidir. Embriyoların yumurta sarısı çuvallar çıkarıldı sonra (video gösterilmez) hızlı dekapite olmalıdır.
Sıcaklık yanı sıra rotor hız da çok önemlidir. Enzimatik aktivasyonu ve NCSCM için gerekli faktörleri nitelik ve nicelik bir azalma önlemek için santrifüj ve rotor sıcaklığı 4 azaltılmalıdır ° C Santrifüj adımdan sonra net merkezi sıvı faz NCSCM için gerekli büyüme faktörleri içeren önemli ön özü. Farklı fraksiyonları önemli bir ayrılık ve faktörlerin bir zenginlik elde etmek için 180.000 xgx saat daha düşük bir hız değil tavsiye gerekli
Santrifüj tüpünün üstündeki berrak sıvı faz ve pis sıvı faz arasındaki yoğunluk farkı, kaçınılması gereken herhangi bir sallayarak iki bölümden bir remix engel değildir. Pis sıvı faz bileşenleri, yağ parçaları çok yakında filtre sistemi bir tıkanmaya yol açacak gibi 0.45 mikron filtre sistemi ile filtre edemez. Ayrıca santrifüj altındaki pelet parçaları filtre sistemi tıkanmaya yol açacak gibi, hiç dokunulmaz olmamalıdır.
Son bir adım NCSCs ekimi için CEE potansiyel doğrulanmış olması gerekir. Bu multipotent geçici nüfus kök hücrelerin yeterli üretilen CEE eklendi kalmadan medya hızla onun canlılığını kaybeder. Bu nedenle, transgen aktivite bağımlı bir şekilde erken NCSC belirteçler ifade ve NCSC biyolojisini çalışmak için kullanılan bir transgenik fare hattı (JoMa1) 10 CEE her yeni elde sorumlu yetiştirilmektedir . NCSCs başarılı ekimi CEE uygun bir doğrulama temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Markus Pajtler ve Robert Bohrer destek ve danışmanlık, bu protokol görselleştirme için paha biçilemez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 days incubated chicken eggs | Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH | ||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke Mayr GmbH | ||
| DMEMGlutamax | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | ||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | ||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | ||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific | ||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One | ||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
