Summary
Эффективный протокол для
Abstract
Как сообщалось, больных раком молочной железы у уже существующих иммунного ответа против 1,2 опухолей. Однако такие иммунные реакции не обеспечивают полную защиту от развития или рецидива рака молочной железы. Чтобы преодолеть эту проблему путем увеличения частоты опухолевых-реактивных Т-клеток, усыновителей иммунотерапии был принят на работу. Различные протоколы были использованы для расширения опухолеспецифические Т-клеток. Эти протоколы, однако, ограничивается использование опухоли естественных бывший антигенов для активации антиген-специфических Т-клеток. Совсем недавно, общая гамма цепи цитокинов, таких как IL-2, ИЛ-7, Ил-15 и Ил-21 были использованы отдельно или в комбинации для повышения противоопухолевого иммунного ответа 3. Тем не менее, не ясно, что формулировка будет работать лучше всего на расширение опухоли реактивных Т-клеток. Здесь мы приводим протокол для селективной активации и расширению опухоли реактивных Т-клеток от FVBN202 трансгенной мышиной модели HER-2/neu положительным раком молочной железы для использования в приемных Т-клеточной терапии рака молочной железы. Протокол включает в себя активацию Т-клеток с bryostatin-1/ionomycin (B / I) и ИЛ-2 при отсутствии опухолевых антигенов в течение 16 часов. B / I имитирует активации внутриклеточных сигналов, которые приводят к активации Т-клеток за счет увеличения протеинкиназы С активности и внутриклеточного кальция, соответственно, 4. Этот протокол специально активирует опухоль-специфический Т-клеток, убивая не имеет значения Т-клеток. B / I активированных Т-клетки культивировали с IL-7 и ИЛ-15 в течение 24 часов, а затем импульсным ИЛ-2. После 24 часов, Т-клетки промывают, раскол, и культивируют с IL-7 + ИЛ-15 для 4 дополнительных дней. Опухоль-специфичность и противоопухолевой эффективности исключая виво расширил Т-клеток определяется.
Protocol
1. Выделение лимфоцитов 5
- Изолировать опухоли дренаж лимфатических узлов или селезенки с опухолями FVBN202 трансгенных мышей и подготовить суспензии отдельных клеток в ледяной RPMI1640 с добавлением 10% FBS. B / I активации в 50-мл полипропиленовые трубы конической результаты в большей выход Т-клеток по сравнению с полистиролом труб. Кетамин и Ксилазин вводят IP для анестезии. Шейки дислокации используется в качестве метода эвтаназии.
- Культура клетки (10 6 клеток / мл) в полной среде, содержащей 15% FBS с бриостатин-1 (5 нм) и иономицина (1 мкМ), а также 80 ед / мл ИЛ-2 (Peprotech) в течение 16 ч.
- Вымойте клетки три раза теплой среде (37 ° С) и культуры на 10 6 клеток / мл в полной среде с IL-7 (10 нг / мл) и IL-15 (10 нг / мл) (Peprotech) в течение 24 ч .
- Импульсный клетки с ИЛ-2 (40 ед / мл) в течение 24 ч.
- Разделение клеток и культуру их с IL-7 и ИЛ-15 (10 нг / мл) в течение 4 дней. Изменение средних и разделить клетки при необходимости каждые 2 дня.
2. Определите Fold расширения Т-клеток путем клеток и проточной цитометрии Анализ 5
- Клеток с помощью световой микроскопии
- Подготовка соответствующего разбавления ячейки (1:100) в трипанового синего и добавить несколько мкл на гемоцитометра
- Графа 9 квадратов и определить общего числа клеток путем деления клеток, чтобы количество камер умножается на коэффициент разбавления. Результаты поиска будут содержать числа х 10 4 клеток / мл.
- Определить долю CD8 + и CD4 + Т-клеток в клетки расширена с помощью проточной цитометрии
- Блок неспецифического связывания антител к Fc-рецепторов при культивировании клеток с anti-CD16/CD32 антител (Biolegend) в течение 20 мин на льду и затем промыть клетки в два раза с 2 мл ледяной PBS с добавлением 1% азида натрия .
- Пятно клетки при культивировании с FITC-CD4 и CD8 PE-антител в течение 20 мин на льду и затем промыть клетки в два раза с 2 мл ледяной PBS с добавлением 1% FBS и 0,1% азида натрия.
- Fix клеток с 1% параформальдегида и запускать образцы на Beckman Coulter FC 500 и анализ использования саммита версии 4.3 программного обеспечения.
3. Определите опухоли-специфичности бывших Расширенное Vivo Т-клетки
- Культура исключая виво расширен лимфоцитов в полной среде в соотношении 10:1 с облученным нейтронов положительные опухолевые клетки MMC (15 000 рад) в течение 24 ч. 5
- Урожай супернатанты и хранить при температуре -80 ° С до использования. 5,6
- Обнаружение IFN-γ использованием мыши ИФН-γ ИФА Set (BD Pharmingen) в соответствии с протоколом производителя. 5,6
4. Определите Противоопухолевый Функция бывших Расширенное Vivo Т-клеток 5,6
- Инкубируйте Т-клеток с опухолевыми клетками в 10:01 эффекторных: целевые отношения в течение 48 часов в полной среде в 3 мл полной среды (RPMI-1640 дополнен 100U / мл пенициллина, 100μg / мл стрептомицина, 10% FBS, глютамина и β - меркаптоэтанол) и 20U / мл ИЛ-2 (Peprotech) в 6 также блюда культуры 37 ° C / 5% СО 2.
- Выполните три цвета окраски антител для нейтронов (anti-c-Erb2/c-neu, клон-4, Calbiochem), затем РЕ-анти мышь IgG, Аннексин V-FITC и пропидия йодидом (PI) в соответствии с протоколом производителя (BD Pharmingen)
- Ворота на нейтронов положительных клеток опухоли и анализа жизнеспособности (Аннексин V-/PI-) опухолевых клеток
5. Мышиной модели рака молочной железы
FVBN202 трансгенных самок мышей (Charles River Laboratories) может быть использован для источника опухоли реактивных Т-клеток. Эти мыши гиперэкспрессией неактивированных крысы нейтронов трансгенов под контролем промотора MMTV и в результате спонтанного развиваться рак молочной железы между 4-10 месяцев 7. Эти мыши развиваться предраковые молочной гиперплазии похож на протоковой карциномы (DCIS) до развития спонтанных carcinoma8. Спонтанные опухоли мышей используются в качестве доноров Т-клеток.
6. Представитель Результаты:
Активация Т-клеток с B / I в течение 16 часов приводит к убийству наивных Т-клеток, которые не являются сенсибилизированные опухолей в естественных условиях. После B / I селективность опухоли реактивных Т-клеток, они расширяются до 2,8 раза в течение 6-дневной культуры с гамма цепи цитокинов (рис. 1). Оба CD8 + и CD4 + Т-клеток, в равной степени расширена гамма цепи цитокинов (рис. 2). Исключая виво расширенной Т-клетки проявляют высокую отзывчивость по отношению к опухоли, что донорские мышей, чувствительным к, как оценивается производство IFN-γ в присутствии нейтронов положительный рак молочной железы мыши (MMC), опухолевых клеток (рис. 3). Исключая виво расширил Т-клетки могут вызывать апоптоз в нейтроны положительный чел опухоли MMCLs, что жизнеспособность опухолевых клеток снижается с 92% до 61% в течение 48 часов (рис. 4).
Рисунок 1. Сложите расширение лимфоцитов в различные моменты времени следующие B / I активации (день 1) и экс расширения естественных условиях с цитокинами гамма цепи (дни 3, 5 и 7)
Рисунок 2. Всего процент CD4 + и CD8 + Т-клеток до и после 7-дневного расширения с цитокинами гамма цепи.
Рисунок 3. Опухоли-стимулированной IFN-γ производства Т-клеток, выделенных из опухолей мышей до и после 7-дневного расширения с цитокинами гамма цепи, с помощью IFN-γ ИФА
Рисунок 4. Цитотоксические функции исключая виво расширил Т-клеток с цитокинами гамма цепи против нейтронов положительный рак молочной железы мыши (MMC) опухолевых клеток
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Селективный расширение опухоли-реактивный Т-клеток с эффекторной противоопухолевой функция может быть достигнуто за счет предлагаемого протокола использованием B / I активации и экс расширения естественных условиях с гамма цепи цитокинов IL-2, ИЛ-7 и ИЛ-15. Хотя ИЛ-2 Т фактор роста клеток, которые могут поддерживать дифференциации и расширения антиген-специфических Т-клеток, IL-7 может ингибировать апоптоз Т-клеток и поддержания их жизнеспособности в процессе расширения. Ил-15 может поддерживать память Т-клеток, которые являются важными для создания долгосрочных противоопухолевого ответа от приемных Т клеточной терапии 9-11. Изменение порядка и сочетания этих цитокинов могут повлиять на дифференциацию расширил Т-клетки, в свою очередь может улучшить или уменьшить их противоопухолевую эффективность 12. Предлагаемого протокола не потребует идентификации опухолевых антигенов. Селективный расширение опухоли-реактивный Т-клетки приводит к производству большого количества противоопухолевых Т-клеток, которые могут быть использованы для приемных Т клеточной терапии онкологических больных. Ранее нами было показано, что экс естественных расширил Т-клетки охраняемых животных против рака молочной железы следующие приемные Т клеточной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH R01 CA104757 Грант (MH Manjili). Мы выражаем искреннюю благодарность поддержке VCU Massey онкологический центр и Фонд Содружества по исследованию рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
