Summary
Için verimli bir protokol
Abstract
Meme kanseri hastalarının, tümörler 1,2 karşı önceden var olan bağışıklık yanıtlarını olduğu bildirilmiştir . Ancak, bu tür bağışıklık yanıtlarını meme kanseri geliştirme veya nüks karşı tam koruma sağlamak için başarısız olur. Tümör-reaktif T hücrelerinin sıklığı artırarak bu sorunu aşmak için, evlatlık immünoterapi istihdam edilmiştir. Tümör spesifik T hücrelerinin genişlemesi için çeşitli protokoller kullanılmaktadır. Bu protokoller, ancak tümör antijenleri ex vivo antijen-spesifik T hücrelerinin aktivasyonu için kullanımı sınırlıdır. Çok yakın bir zamanda, ortak gama zinciri sitokinler, IL-2, IL-7, IL-15, ve IL-21 gibi, anti-tümör immün yanıtların 3 geliştirme için tek başına veya kombine olarak kullanılır olmuştur. Ancak, bu formülasyon, tümör-reaktif T hücrelerinin genişlemesi için en iyi çalışmalarınızı ne açık değildir. Burada HER-2/neu evlatlık T hücre tedavisi meme kanseri kullanmak için pozitif meme kanseri FVBN202 transgenik fare modelinde tümör-reaktif T hücrelerinin selektif aktivasyonu ve genişleme için bir protokol mevcut. Bu protokol, 16 saat boyunca tümör antijenleri yokluğunda bryostatin-1/ionomycin (B / I) ve IL-2 ile T hücrelerinin aktivasyonunu içerir. B / I aktivasyonu hücre içi sinyalleri taklit eden, sırasıyla 4, protein kinaz C aktivitesi ve hücre içi kalsiyum artırarak T hücre aktivasyonu ile sonuçlanabilir . Bu protokol ilgisiz T hücreleri öldürüyor iken, özellikle tümör spesifik T hücrelerini aktive eder. B / I-aktive T hücreleri, IL-7 ve IL-15 ile 24 saat boyunca kültür ve sonra IL-2 ile darbeli. 24 saat sonra, T hücreleri, split yıkanmış ve kültürlü, IL-7 + ek 4 gün IL-15. Ex vivo genişletilmiş T hücrelerinin tümör özgüllük ve anti-tümör etkinliği belirlenir.
Protocol
1. Lenfositler 5 izolasyonu
- Isolate tümör drenaj lenf düğümleri veya FVBN202 tümör taşıyan transgenik farelerin dalak ve buz RPMI1640 tek hücre süspansiyonu hazırlamak% 10 FBS ile desteklenmiştir. Polistiren tüplere göre daha büyük bir T hücre verimi 50 ml polipropilen konik tüpler sonuçları B / I aktivasyon. Ketamin ve Xylazine anestezi için ip enjekte edilir. Servikal dislokasyon ötenazi bir yöntem olarak kullanılmaktadır.
- Kültür bryostatin-1 (5 nM) ve ionomycin (1 mcM) ile 80 U / ml, IL-2 (Peprotech) ile birlikte 16 saat boyunca% 15 FBS içeren tam bir ortamda hücrelerin (10 6 hücre / ml )
- IL-7 (10 ng / ml) ve IL-15 (10 ng / ml) (Peprotech) ile 24 saat boyunca tam bir ortamda 10 6 hücre / ml sıcak ortam (37 ° C) ve kültür hücreleri üç kez yıkayın .
- IL-2 (40 U / ml) ile 24 saat hücrelerin Darbe
- Split IL-7 ve IL-15 ile 4 gün boyunca daha fazla hücre ve kültür (10 ng / ml). Orta Değişim ve 2 günde gerektiğinde hücreleri bölme.
2. Hücre sayar ve Akış Sitometri Analizi 5 T Hücre Katlama Genişleme belirleyin
- Işık mikroskobu ile hücre sayımı
- Tripan mavisi uygun hücre seyreltme (1:100) hazırlayın ve üzerine birkaç mcL hemasitometre
- 9 kareler sayın ve seyreltme faktörü ile çarpılır odaları sayısına bölünmesi ile hücre sayıları toplam hücre sayısını belirlemek. Sonuç sayısı x 10 4 hücre / mL sunacak.
- Flow sitometri ile genişletilmiş hücreleri CD8 + ve CD4 + T hücreleri oranı belirleme
- 20 dakika buz üzerinde anti-CD16/CD32 antikor (Biolegend) ile kültür Fc reseptörlerine karşı antikorlar non-spesifik bağlayıcı hücreleri Blok ve ardından buz gibi soğuk PBS 2 mL hücreler iki kez yıkamak% 1 sodyum azid ile desteklenmiş .
- 20 dakika buz üzerinde FITC CD4 ve PE-CD8 antikorlar ile kültür hücreleri tarafından Leke ve daha sonra 2 ml% 1 FBS ve% 0,1 sodyum azid ile tamamlanan buz gibi soğuk PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
- % 1 paraformaldehid hücreleri saptamak ve Beckman Coulter FC 500 numunelerinin çalışılabilmesi ve Zirvesi sürüm 4.3 yazılımı kullanılarak analiz.
3. Eski Vivo Tümör özgüllüğü belirleyin T Hücreler Genişletilmiş
- Kültür ex vivo ışınlanmış neu pozitif MMC tümör hücreleri ile 10:1 oranını (15.000 rad) 24 saat 5 tam orta lenfosit genişletti
- -80 ° C'ye kadar Hasat süpernatantlar ve saklayın. 5,6
- Algılama IFN-γ üreticinin protokole göre Fare IFN-γ ELISA Seti (BD Pharmingen) ile 5,6
4. Eski Vivo Genişletilmiş T Hücreleri 5,6 Anti-tümör Fonksiyon belirleyin
- 3 ml tam orta (RPMI-1640 100U / ml penisilin, 100μg / ml streptomisin, glutamin ve β% 10 FBS ile takviye tam bir ortamda 48 saat süreyle hedef oranları: 10:1 efektör T hücrelerinin tümör hücreleri ile inkübe - merkaptoetanol) ve 6 kuyu kültür yemekleri 37 ° C /% 5 CO 2, IL-2 (Peprotech) 20U / ml.
- Üretici firmanın protokolüne göre PE-anti-fare IgG, Annexin V-FITC ve Propidium İyodür (PI) (BD Pharmingen) tarafından takip neu için üç renk antikor boyama (anti-c-Erb2/c-neu, klon-4, Calbiochem) yapın
- Neu pozitif tümör hücreleri Kapısı ve analiz tümör hücrelerinin canlılığı (Annexin V-/PI-)
5. Meme Kanseri Fare Modeli
FVBN202 transgenik (Charles River Laboratuvarları) dişi farelerde tümör-reaktif T hücrelerinin kaynağı için kullanılabilir. Bu fareler MMTV organizatörü Yönetmelik kapsamında etkisizleştirilir sıçan neu transgen eksprese ve bunun sonucu olarak 4-10 ay, 7 yaş arasında spontan meme karsinomu geliştirmek . Bu farelerin spontan carcinoma8 gelişimi için önce duktal karsinoma in situ (DCIS) 'e benzer premalign meme hiperplazi gelişir. Spontan Tümör taşıyan farelere T hücre vericisi olarak kullanılır.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
In vivo tümör duyarlı değildir naif T hücrelerinin öldürülmesi 16 saat sonuçlar için B / I ile T hücrelerinin aktivasyonu. Gama zinciri sitokinler (Şekil 1) ile 6 günlük bir kültürün içinde 2.8 kat kadar genişletmek tümör-reaktif T hücreleri B / I seçicilik sonra. CD8 + ve CD4 + T hücreleri eşit gama zinciri sitokinler (Şekil 2) ile genişletilmiş. Ex vivo genişletilmiş T hücreleri neu pozitif fare meme karsinom (MMC), tümör hücreleri (Şekil 3) varlığı, IFN-γ üretimi değerlendirilir olarak donör fareler, karşı alerjisi olan tümörlere karşı yüksek tepki gösteriyor . T hücrelerinin ex vivo genişletilmiş neu pozitif MMC tümör cel apoptozisi uyarabilirtümör hücreleri, bu canlılığı ls% 92 dan% 61 (Şekil 4) 48 saat içinde düşer.
Şekil 1 B / I aktivasyonu (1. gün) ve gama zinciri sitokinler ile ex vivo genişlemesi (3, 5 ve 7 gün) sonra farklı zaman noktalarında lenfosit Katlama genişleme
Şekil 2 CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin toplam yüzdesi gama zinciri sitokinler ile 7 günlük bir genişleme öncesi ve sonrası.
Şekil 3: Tümör-uyarılmış IFN-γ kullanarak Tümör taşıyan farelere gama zinciri sitokinler ile 7 günlük bir genişleme öncesinde ve sonrasında izole edilen T hücrelerinin üretimi, IFN-γ ELISA
Şekil 4 Sitotoksik T hücrelerinin genişletilmiş neu pozitif fare meme karsinom (MMC), tümör hücrelerinin karşı gama zinciri sitokinler ile ex vivo fonksiyonu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Seçici genişleme efektör anti-tümör işlevi tümör-reaktif T hücrelerinin B kullanarak önerilen protokol ile elde edilebilir I / aktivasyonu ve gama zinciri sitokinler IL-2, IL-7 ve IL-15 ile ex vivo genişlemesi. IL-2, antijen-spesifik T hücrelerinin farklılaşması ve genişleme destek T hücre büyüme faktörü iken, IL-7, T hücreleri, apoptozis inhibe eder ve genişleme sırasında canlılığı destekleyecek. IL-15, uzun vadeli bir anti-tümör cevapların evlatlık T hücre tedavisi 9-11 üzerine üretmek için önemli olan bellek T hücreleri destek olabilir . Bu sitokinlerin sipariş ve kombinasyon değiştirme, sırayla anti-tümör etkinliği 12 artırmak veya azaltmak genişletilmiş T hücre farklılaşması etkileyebilir . Önerilen protokol tümör antijenlerinin belirlenmesi gerek olmayacak. Kanser hastalarının evlatlık T hücre tedavisi için kullanılan anti-tümör T hücrelerinin yüksek sayıda üretim tümör-reaktif T hücrelerinin sonuçları seçici bir genişleme. Biz daha önce, ex vivo olarak evlat edinen T hücre tedavisi sonrası meme kanserine karşı korumalı T hücreleri hayvanlar genişletilmiş gösterilmiştir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili) tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle VCU Massey Kanser Merkezi ve Commonwealth Kanser Araştırma Vakfı desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
