Summary
Ett effektivt protokoll för
Abstract
Det rapporterades att bröstcancer patienter har tidigare immunsvar mot sina tumörer 1,2. Sådana immunsvaret inte ger fullständigt skydd mot utveckling eller återfall av bröstcancer. För att lösa detta problem genom att öka frekvensen av tumörreaktiva T-celler, har adoptiv immunterapi använts. En mängd olika protokoll som har använts för utbyggnad av tumör-specifika T-celler. Dessa protokoll är dock begränsad till användning av tumörantigen ex vivo för aktivering av antigen-specifika T-celler. Helt nyligen har gemensamma gamma kedjan cytokiner såsom IL-2, IL-7, IL-15 och IL-21 har använts ensamt eller i kombination för att höja anti-tumör immunsvar 3. Det är dock inte klart vilken formulering skulle fungera bäst för utbyggnaden av tumörreaktiva T-celler. Här presenterar vi ett protokoll för selektiv aktivering och expansion av tumörreaktiva T-celler från FVBN202 transgena musmodell av HER-2/neu positiv bröstcancer för användning i adoptiv T cells behandling av bröstcancer. Protokollet inkluderar aktivering av T celler med bryostatin-1/ionomycin (B / I) och IL-2 i avsaknad av tumörantigen i 16 timmar. B / I aktivering härmar intracellulära signaler som leder till T-cell aktivering genom att öka proteinkinas C-aktivitet och intracellulär kalcium, respektive 4. Detta protokoll aktiverar specifikt tumör-specifika T-celler medan dödar irrelevanta T-celler. The B / I-aktiverade T-celler odlas med IL-7 och IL-15 för 24 timmar och sedan pulsade med IL-2. Efter 24 timmar är T-cellerna tvättas, split, och odlade med IL-7 + IL-15 för ytterligare 4 dagar. Tumör-specificitet och anti-tumör effekt av fritt expanderat vivo T-celler bestäms.
Protocol
1. Isolering av lymfocyter 5
- Isolera tumör-dränerande lymfkörtlar eller mjälte från tumör-bärande FVBN202 transgena möss och förbereda enskild cell suspension i iskallt RPMI1640 kompletterad med 10% FBS. B / I-aktivering i 50-ml polypropylen koniska rör resulterar i en större T-cell avkastning jämfört med polystyren rör. Ketamin och xylazin injiceras IP för anestesi. Halsdislokation används som en metod för dödshjälp.
- Kultur cellerna (10 6 celler / ml) i komplett medium som innehåller 15% FBS med Bryostatin-1 (5 nM) och ionomycin (1 M) tillsammans med 80 U / mL av IL-2 (Peprotech) i 16 h.
- Tvätta cellerna tre gånger med varmt medium (37 ° C) och kultur vid 10 6 celler / ml i fullständig medium med IL-7 (10 ng / ml) och IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) för 24 timmar .
- Puls cellerna med IL-2 (40 U / ml) i 24 h.
- Dela cellerna och kultur dem med IL-7 och IL-15 (10 ng / ml) i 4 dagar. Ändra medium och dela celler om det behövs varje 2 dagar.
2. Bestäm Vik Utbyggnad av T-celler med celler och flödescytometri analys 5
- Celltalet med ljusmikroskopi
- Förbereda lämpliga cell spädning (1:100) i trypan blått och tillsätt några mikroliter på hemocytometer
- Räkna 9 rutor och bestämma totalt antal celler genom att dela cell räknar till antalet kamrar multipliceras med spädningsfaktorn. Resultaten kommer att presentera nummer x 10 4 celler / ml.
- Bestäm andelen CD8 + och CD4 + T-celler i den utökade celler med flödescytometri
- Blockera icke-specifik bindning av antikroppar mot Fc-receptorer genom odling av celler med anti-CD16/CD32 antikropp (Biolegend) i 20 minuter på is och sedan tvätta cellerna två gånger med 2 ml iskall PBS kompletterad med 1% natriumazid .
- Färga cellerna genom odling med FITC-CD4 och PE-CD8 antikroppar i 20 minuter på is och sedan tvätta cellerna två gånger med 2 ml iskall PBS kompletterad med 1% FBS och 0,1% natriumazid.
- Fixera cellerna med 1% paraformaldehyd och köra prover på ett Beckman Coulter FC 500 och analysera med hjälp av toppmötet version 4.3 programvara.
3. Bestäm Tumör-specificitet ex vivo Utökad T-celler
- Kultur för ex vivo expanderade lymfocyterna i fullständig medium vid en 10:01 förhållandet med bestrålade Neu positiva MMC tumörceller (15.000 rad) för 24 timmar 5
- Harvest supernatanterna och förvara vid -80 ° C tills används. 5,6
- Identifiera IFN-γ använda en mus IFN-γ ELISA Set (BD Pharmingen) enligt tillverkarens protokollet. 5,6
4. Bestäm tumörhämmande Funktion hos ex vivo Utökad T-celler 5,6
- Inkubera T-celler med tumörceller i en 10:01 effektor: mål nyckeltal i 48 timmar i komplett medium vid 3 mL komplett medium (RPMI-1640 kompletteras med 100U / ml penicillin, 100μg / ml streptomycin, 10% FBS, glutamin och β - merkaptoetanol) och 20U / ml av IL-2 (Peprotech) på 6 och kultur rätter 37 ° C / 5% CO 2.
- Utför tre färgning färg antikropp för Neu (anti-c-Erb2/c-neu, klon-4, Calbiochem) följt av PE-anti mus IgG, Annexin V-FITC och propidiumjodid (PI) enligt tillverkarens protokoll (BD Pharmingen)
- Gate på Neu positiva tumörceller och analysera lönsamheten (Annexin V-/PI-) av tumörcellerna
5. Musmodell av bröstcancer
FVBN202 transgena honmöss (Charles River Laboratories) kan användas för källan till tumörreaktiva T-celler. Dessa möss överuttrycker en inaktiverad råtta Neu transgenen reglerad av MMTV promotor och som ett resultat utvecklar spontan bröstcancer mellan 4-10 månaders ålder 7. Dessa möss utvecklar premaligna bröst hyperplasi liknar duktal cancer in situ (DCIS) innan utvecklingen av spontana carcinoma8. Spontan tumör-bärande möss används som givare av T-celler.
6. Representativa resultat:
Aktivering av T-celler med B / jag i 16 timmar resulterar i dödandet av naiva T-celler som inte är sensibiliserade med tumören in vivo. Efter B / I selektivitet tumörreaktiva T-celler de expanderar upp till 2,8 gånger inom en 6-dagars kultur med cytokiner gamma kedjan (Figur 1). Både CD8 + och CD4 + T-celler är lika utökas med cytokiner gamma kedjan (Figur 2). Den ex vivo-expanderade T-celler visar stora lyhördhet mot tumörer som donator möss sensibiliserade för, som utvärderats av produktionen av IFN-γ i närvaro av Neu positiva mus bröstcancer (MMC) tumörceller (Figur 3). Den ex vivo expanderade T-celler kan inducera apoptos i Neu positiva MMC tumör CELÄr så att lönsamheten av tumörcellerna sjunker från 92% till 61% inom 48 timmar (Figur 4).
Figur 1. Vik expansion av lymfocyter vid olika tidpunkter efter B / I-aktivering (dag 1) och ex vivo expansion med de cytokiner gamma-kedjan (dag 3, 5 och 7)
Figur 2. Totala andelen CD4 + och CD8 + T-celler före och efter en 7-dagars expansion med de cytokiner gamma kedjan.
Figur 3. Tumör-stimulerade IFN-γ produktion av T-celler isolerade från tumör-bärande möss före och efter en 7-dagars expansion med de cytokiner gamma-kedjan, med hjälp av IFN-γ ELISA
Figur 4. Cytotoxic funktion av ex vivo expanderade T-celler med cytokiner gamma kedjan mot Neu positiva mus bröstcancer (MMC) tumörceller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektiv expansion av tumör-reaktiva T-celler med effektormedierad anti-tumör-funktionen kan uppnås genom det föreslagna protokollet med B / I aktivering och ex vivo expansion med de cytokiner gamma-kedjan IL-2, IL-7 och IL-15. Medan IL-2 är en T-cell tillväxtfaktor som kan stödja differentiering och expansion av antigen-specifika T-celler, kan IL-7 hämmar apoptos av T-celler och stödja deras livskraft under expansion. IL-15 kan stödja celler minne T som är viktiga för att generera långsiktigt anti-tumör svar på adoptiv T cellterapi 9-11. Ändra ordning och kombinationen av dessa cytokiner kan påverka differentiering av den utvidgade T-celler som i sin tur kan förbättra eller minska sina anti-tumör effekt 12. Den föreslagna protokollet kommer inte att kräva identifiering av tumörantigen. Selektiv expansion av tumör-reaktiva T-celler leder till produktion av ett stort antal anti-tumör T-celler som kan användas för adoptiv T cells behandling av cancerpatienter. Vi har tidigare visat att ex vivo expanderade T-celler skyddade djur mot bröstcancer efter adoptiv T cellterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Vi erkänner tacksamt stöd av OAV Massey Cancer Center och Commonwealth Stiftelsen för cancerforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
