Summary
Ein effizientes Protokoll für die
Abstract
Es wurde berichtet, dass Brustkrebs-Patientinnen bereits bestehende Immunantworten gegen ihren Tumoren 1,2 haben. Allerdings scheitern solche Immunantwort auf einen vollständigen Schutz gegen die Entwicklung oder Wiederauftreten von Brustkrebs bieten. Zur Lösung dieses Problems durch die Erhöhung der Häufigkeit von Tumor-reaktiven T-Zellen hat adoptiven Immuntherapie eingesetzt. Eine Vielzahl von Protokollen für die Expansion von Tumor-spezifischen T-Zellen verwendet wurden. Diese Protokolle sind jedoch die Verwendung von Tumor-Antigenen ex vivo für die Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen beschränkt. Vor kurzem haben gemeinsame gamma-Kette Zytokine wie IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 wurden allein oder in Kombination zur Verbesserung der Anti-Tumor-Immunantwort 3 verwendet. Es ist jedoch nicht klar, was Formulierung am besten für die Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die selektive Aktivierung und Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen aus dem FVBN202 transgenen Mausmodell der HER-2/neu positiven Mammakarzinoms für den Einsatz in adoptiven T-Zell-Therapie von Brustkrebs. Das Protokoll umfasst die Aktivierung von T-Zellen mit bryostatin-1/ionomycin (B / I) und IL-2 in Abwesenheit von Tumor-Antigenen für 16 Stunden. B / I Aktivierung imitiert intrazelluläre Signale, die sich in T-Zell-Aktivierung durch die Erhöhung Proteinkinase C Aktivität und den intrazellulären Kalzium-, bzw. 4. Dieses Protokoll ausdrücklich aktiviert tumor-spezifische T-Zellen, während das Töten irrelevant T-Zellen. Die B / I-aktivierten T-Zellen werden mit IL-7 und IL-15 für 24 Stunden kultiviert und anschließend mit IL-2 gepulst. Nach 24 Stunden, T-Zellen werden gewaschen, halbiert und mit kultivierten IL-7 + IL-15 für weitere 4 Tage. Tumor-Spezifität und anti-Tumor-Wirksamkeit des ex vivo expandierten T-Zellen bestimmt.
Protocol
1. Isolierung von Lymphozyten 5
- Isolieren Tumor-drainierenden Lymphknoten oder Milz von tumortragenden FVBN202 transgenen Mäusen und bereiten einzelne Zellsuspension in eiskaltem RPMI1640 mit 10% FBS. B / I-Aktivierung in 50-ml-Polypropylen-konische Gefäße führt zu einer größeren T-Zell-Ausbeute auf Polystyrol-Röhrchen verglichen. Ketamin und Xylazin injiziert ip für die Anästhesie. Genickbruch ist als eine Methode der Euthanasie verwendet.
- Kultur der Zellen (10 6 Zellen / ml) in Vollmedium mit 15% FBS mit Bryostatin-1 (5 nM) und Ionomycin (1 pM) zusammen mit 80 U / ml IL-2 (PeproTech) für 16 h.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit warmem Medium (37 ° C) und die Kultur bei 10 6 Zellen / ml in komplettem Medium mit IL-7 (10 ng / ml) und IL-15 (10 ng / mL) (PeproTech) für 24 h .
- Pulse der Zellen mit IL-2 (40 U / mL) für 24 h.
- Split der Zellen und Kultur sie mit IL-7 und IL-15 (10 ng / mL) für 4 Tage. Ändern Sie mittel-und spaltete die Zellen, wenn jeder benötigt 2 Tage.
2. Bestimmen Sie falten Expansion von T-Zellen durch Zellzahlen und Durchflusszytometrie Analyse 5
- Die Zellzahlen mittels Lichtmikroskopie
- Bereiten Sie entsprechende Zelle Verdünnung (1:100) in Trypanblau und fügen einige ul auf Hämozytometer
- Count 9 Felder und bestimmen gesamte Zellzahl, indem Zellzahl, die Anzahl der Kammern mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Die Ergebnisse präsentieren Anzahl x 10 4 Zellen / ml.
- Bestimmen Anteil der CD8 + und CD4 + T-Zellen in der expandierten Zellen mittels Durchflusszytometrie
- Block nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren durch Kultivierung der Zellen mit anti-CD16/CD32 Antikörper (Biolegend) für 20 min auf Eis und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml eiskaltem PBS mit 1% Natriumazid .
- Stain die Zellen durch Kultivierung mit FITC-CD4 und PE-CD8-Antikörper für 20 min auf Eis und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml eiskaltem PBS mit 1% FBS und 0,1% Natriumazid ergänzt.
- Fix die Zellen mit 1% Paraformaldehyd und laufen Proben auf einem Beckman Coulter FC 500 und analysieren mit Summit Version 4.3 Software.
3. Bestimmen Tumor-Spezifität der ex vivo expandierte T-Zellen
- Kultur der ex vivo expandierten Lymphozyten in Vollmedium bei einem Verhältnis von 10:1 mit bestrahlten neu positive MMC Tumorzellen (15.000 rad) für 24 h. 5
- Ernte Überstände und bei -80 ° C bis zur Verwendung. 5,6
- Detect IFN-γ mit einem Maus-IFN-γ ELISA-Set (BD Pharmingen) nach dem Protokoll des Herstellers. 5,6
4. Bestimmen Sie Anti-Tumor-Funktion des ex vivo expandierte T Cells 5,6
- Inkubieren T-Zellen mit Tumorzellen in einem 10:1 Effektor: Target-Verhältnis für 48 Stunden in Vollmedium bei 3 ml Vollmedium (RPMI-1640 ergänzt mit 100U / ml Penicillin, 100 &mgr; g / ml Streptomycin, 10% FBS, Glutamin und β - Mercaptoethanol) und 20U / ml IL-2 (PeproTech) in 6-Well Kulturschalen 37 ° C / 5% CO 2.
- Führen Sie drei Farb-Antikörper-Färbung für neu (anti-c-Erb2/c-neu, Klon-4, Calbiochem) von PE-anti-Maus IgG, Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) nach dem Protokoll des Herstellers (BD Pharmingen), gefolgt
- Gate auf neu positive Tumorzellen und zu analysieren Lebensfähigkeit (Annexin V-/PI-) der Tumorzellen
5. Mausmodell für Brustkrebs
FVBN202 transgenen weiblichen Mäusen (Charles River Laboratories) für die Quelle von tumor-reaktiven T-Zellen verwendet werden. Diese Mäuse überexprimieren ein nicht aktiviertes Ratte neu Transgen unter der Kontrolle eines MMTV-Promotor und als Folge entwickeln spontane Mammakarzinom zwischen 4-10 Monaten ab 7 Jahren. Diese Mäuse entwickeln prämalignen Mamma Hyperplasie ähnlich duktales Carcinoma in situ (DCIS) vor der Entwicklung des spontanen carcinoma8. Spontane tumortragenden Mäusen als Spender von T-Zellen verwendet.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Die Aktivierung von T-Zellen mit B / I für 16 Stunden Ergebnisse bei der Abtötung von naiven T-Zellen, die nicht sensibilisiert mit dem Tumor in vivo. Nach dem B / I-Selektivität von tumor-reaktiven T-Zellen, die sie erweitern bis zu 2,8-fache innerhalb eines 6-Tages-Kultur mit der gamma-Kette Zytokine (Abbildung 1). Beide CD8 + und CD4 + T-Zellen sind ebenfalls mit der gamma-Kette Zytokine (Abbildung 2) erweitert. Die ex vivo expandierten T-Zellen zeigen eine hohe Reaktionsfähigkeit gegen die Tumoren, die Spender Mäuse sensibilisiert wurden, als durch die Produktion von IFN-γ in Gegenwart von neu positive Maus Mammakarzinom (MMC) Tumorzellen (Abbildung 3) ausgewertet. Die ex vivo expandierten T-Zellen kann die Apoptose in den neu positive MMC Tumor cel induzierenls, so dass die Lebensfähigkeit der Tumorzellen Tropfen von 92% auf 61% innerhalb von 48 Stunden (Abbildung 4).
Abbildung 1. Falten Expansion von Lymphozyten zu verschiedenen Zeitpunkten nach B / I-Aktivierung (Tag 1) und ex vivo Expansion mit der gamma-Kette Zytokine (Tage 3, 5 und 7)
Abbildung 2. Gesamter CD4 + und CD8 + T-Zellen vor und nach einer 7-Tage-Expansion mit der gamma-Kette Zytokine.
Abbildung 3. Tumor-stimulierten IFN-γ Produktion von T-Zellen aus tumortragenden Mäusen vor und nach einer 7-tägigen Expansion mit der gamma-Kette Zytokine isoliert, mit IFN-γ ELISA
Abbildung 4. Zytotoxische Funktion der ex vivo expandierten T-Zellen mit der gamma-Kette Zytokine gegen neu positive Maus Mammakarzinom (MMC) Tumorzellen
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Discussion
Selektiver Ausbau von Tumor-reaktiven T-Zellen mit Effektorfunktionen Anti-Tumor-Funktion kann durch das vorgeschlagene Protokoll mit B erreicht werden / I Aktivierung und ex vivo Expansion mit der gamma-Kette Zytokine IL-2, IL-7 und IL-15. Während IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der die Differenzierung und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen unterstützt, können IL-7 inhibiert die Apoptose von T-Zellen und unterstützen ihre Lebensfähigkeit während der Expansion. IL-15 unterstützt Memory T-Zellen, die wichtig sind für die Erzeugung langfristigen Anti-Tumor-Reaktionen auf adoptiven T-Zelltherapie 9-11. Ändern der Reihenfolge und Kombination dieser Zytokine beeinflussen könnten Differenzierung der erweiterten T-Zellen, was wiederum zu verbessern oder reduzieren ihre Anti-Tumor-Wirksamkeit 12. Mai. Das vorgeschlagene Protokoll wird nicht verlangen, die Identifizierung von Tumor-Antigene. Selektiver Ausbau von Tumor-reaktiven T-Zellen führt zur Produktion von hohen Anzahl von Anti-Tumor-T-Zellen, die für den adoptiven T-Zell-Therapie von Krebspatienten eingesetzt werden kann. Wir haben bereits gezeigt, dass die ex vivo T-Zellen erweitert geschützten Tieren gegen Brustkrebs nach adoptiven T-Zelltherapie.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili) unterstützt. Wir danken für die Unterstützung der VCU Massey Cancer Center und dem Commonwealth Foundation for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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