Summary
פרוטוקול יעיל עבור
Abstract
נמסר כי חולי סרטן השד יש קיימים התגובות החיסוניות נגד גידולים 1,2 שלהם. עם זאת, התגובה החיסונית כאלה אינן מספקות הגנה מלאה מפני התפתחות או הישנות סרטן השד. כדי להתגבר על הבעיה על ידי הגדלת תדירות הגידול-reactive בתאי T, חיסוני המאמצת הועסק. מגוון של פרוטוקולי שימשו להרחבת גידול ספציפי בתאי T. פרוטוקולים אלה, לעומת זאת, מוגבלים לשימוש vivo אנטיגנים סרטניים לשעבר להפעלת אנטיגן ספציפי בתאי T. ממש לאחרונה, נפוץ שרשרת גאמא ציטוקינים כגון IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 שימשו לבד או בשילוב להגברת אנטי הגידול התגובה החיסונית 3. עם זאת, לא ברור מה ניסוח יעבוד בצורה הטובה ביותר להרחבת הגידול ותאי T-reactive. כאן אנו מציגים פרוטוקול להפעלת סלקטיבית והרחבת הגידול ותאי T-reactive ממודל FVBN202 עכבר מהונדס של סרטן שד חיובי HER-2/neu לשימוש בטיפול T המאמצת התא של סרטן השד. הפרוטוקול כולל הפעלה של תאים T עם bryostatin-1/ionomycin (B / I) IL-2 בהעדר אנטיגנים סרטניים במשך 16 שעות. B / הפעלה אני מחקה אותות תאיים כי התוצאה הפעלת תא T על ידי הגדלת הפעילות חלבון kinase C, סידן תוך תאי, בהתאמה 4. פרוטוקול זה במיוחד הגידול מפעיל ספציפי בתאי T תוך הרג ותאי T לא רלוונטי. B / אני המופעל בתאי T הם מתורבתים עם IL-7 ו - IL-15 במשך 24 שעות ו פעמו אז עם IL-2. לאחר 24 שעות, ותאי T נשטפים, מפוצל, ותרבותיים עם IL-7 + IL-15 במשך 4 ימים נוספים. יעילות הגידול סגוליות ואנטי גידול של ex vivo תאים מורחבת T נקבע.
Protocol
1. בידוד של לימפוציטים 5
- בודד הגידול ניקוז בלוטות הלימפה או spleens מן הגידול נושאות FVBN202 העכברים הטרנסגניים ולהכין ההשעיה תא יחיד קר כקרח RPMI1640 בתוספת 10% FBS. B / אני ההפעלה של 50 מ"ל פוליפרופילן תוצאות צינורות חרוטי בתשואה טי תא גדול לעומת צינורות קלקר. קטמין ו Xylazine מוזרקים ip עבור הרדמה. פריקה צוואר הרחם משמש כשיטה של המתת חסד.
- התרבות התאים (10 6 תאים / מ"ל) ב בינוני מלא המכיל 15% FBS עם bryostatin-1 (5 ננומטר) ionomycin (1 מיקרומטר) יחד עם 80 U / mL של IL-2 (Peprotech) עבור 16 ח
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם המדיום חמים (37 מעלות צלזיוס) והתרבות 10 6 תאים / מ"ל במדיום להשלים עם IL-7 (10 ng / mL) ו-IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) עבור 24 שעות .
- דופק את התאים עם IL-2 (40 U / mL) במשך 24 ח
- פיצול תאים והתרבות אותם עם IL-7 ו - IL-15 (10 ng / mL) במשך 4 ימים נוספים. שנה בינונית לפצל את התאים אם יש צורך כל 2 ימים.
2. קביעת הרחבת מקפלים של תאים T על ידי ספירת תאים cytometry זרימה ניתוח 5
- Cell נחשב על ידי מיקרוסקופ אור
- הכן דילול התא המתאים (1:100) ב trypan כחול ולהוסיף כמה μL על hemocytometer
- הרוזן 9 ריבועים לקבוע מספר תאים על ידי חלוקת סך ספירת תא למספר תאים כפול פקטור התימהול. התוצאות יציג מספר x 10 4 תאים / מ"ל.
- קביעת שיעור CD8 + CD4 + ו ותאי T בתאי מורחבת על ידי זרימת cytometry
- בלוק הלא ספציפית מחייב של נוגדנים לקולטנים על ידי Fc culturing התאים עם הנוגדנים anti-CD16/CD32 (Biolegend) במשך 20 דקות על הקרח ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של קר כקרח PBS בתוספת אזיד הנתרן 1% .
- הכתם התאים על ידי culturing עם FITC-CD4 ו PE-CD8 נוגדנים עבור 20 דקות על הקרח ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של קר כקרח PBS בתוספת 1% ו FBS אזיד הנתרן 0.1%.
- תקן את התאים paraformaldehyde 1% ולהפעיל דגימות על Beckman Coulter FC 500 ולנתח בעזרת גרסה 4.3 Summit תוכנה.
3. קביעת גידולים הספציפיות של Vivo לשעבר מורחבת תאים T
- תרבות vivo לשעבר מורחבת הלימפוציטים בינוני מלא ביחס 10:01 עם מוקרן Neu תאים סרטניים חיובי MMC (15,000 rad) עבור 24 ח 5
- קציר supernatants ולאחסן ב -80 ° C עד בשימוש. 5,6
- זיהוי IFN-γ באמצעות עכבר IFN-γ ELISA הגדר (BD Pharmingen) על פי פרוטוקול של היצרן. 5,6
4. קביעה אנטי סרטניים פונקציה של Vivo תאים לשעבר מורחבת T 5,6
- דגירה T תאים עם תאים סרטניים 10:01 מפעיל: יחסי יעד 48 שעות להשלים בינוני בבית בינוני 3 מ"ל מלאה (RPMI-1640 בתוספת 100U / mL של פניצילין, 100μg / סטרפטומיצין מ"ל, 10% FBS, גלוטמין ו - β - mercaptoethanol) ו 20U / mL של IL-2 (Peprotech) ב 6 מנות התרבות גם CO 37 ° C / 5% 2.
- לבצע שלוש נוגדן צבע מכתים עבור Neu (anti-c-Erb2/c-neu, לשבט-4, Calbiochem) ואחריו PE-אנטי עכבר IgG, Annexin V-FITC ו יודיד Propidium (PI) על פי פרוטוקול של היצרן (BD Pharmingen)
- שער על תאים סרטניים Neu חיובי וניתוח כדאיות (Annexin V-/PI-) של תאים סרטניים
5. עכבר דגם של סרטן השד
FVBN202 נקבות העכברים הטרנסגניים (Charles River Laboratories) יכול לשמש מקור הגידול בתאי T-reactive. עכברים אלו overexpress עכברוש לא ממושכת Neu transgene לפי תקנה של האמרגן MMTV וכתוצאה מכך לפתח סרטן השד ספונטנית בין 4-10 חודשים של גיל 7. עכברים אלו לפתח היפרפלזיה החלב טרום ממאיר דומה קרצינומה ductal באתרם (DCIS) לפני התפתחות carcinoma8 ספונטנית. ספונטנית נושאות גידולים בעכברים המשמשים התורמים של תאים T.
6. נציג תוצאות:
הפעלה של תאים עם T / B אני במשך 16 שעות התוצאות בהרג של תמימים בתאי T, כי הם לא רגישים עם הגידול in vivo. לאחר סלקטיביות B / אני הגידול ותאי T-reactive הם להרחיב עד 2.8 פי בתרבות 6 ימים עם שרשרת גאמא ציטוקינים (איור 1). שני CD8 + CD4 + ו ותאי T מורחבות באופן שווה עם שרשרת גאמא ציטוקינים (איור 2). Ex-vivo מורחבת בתאי T להראות היענות גבוהה נגד גידולים בעכברים כי התורם היו רגישים, כפי מוערך על ידי ייצור של IFN-γ בנוכחות קרצינומה של העכבר Neu חיובי החלב (MMC) תאים סרטניים (איור 3). Vivo לשעבר מורחבת בתאי T יכול לגרום אפופטוזיס של cel חיובי הגידול MMC Neuls כדאיות כזו של תאים סרטניים טיפות של% 92 עד% 61 בתוך 48 שעות (איור 4).
באיור 1. התרחבות מקפלים של לימפוציטים בנקודות זמן שונות לאחר הפעלת B / אני (יום 1) והרחבת vivo לשעבר עם ציטוקינים שרשרת גאמא (יום 3, 5 ו 7)
איור 2. האחוז הכולל של CD4 + ו - CD8 + T תאים לפני ואחרי הרחבת 7 ימים עם ציטוקינים שרשרת גאמא.
איור 3. גידולים מגורה IFN-γ הייצור על ידי בתאי T שבודדו נושאות גידולים בעכברים לפני ואחרי הרחבת 7 ימים עם ציטוקינים שרשרת גאמא, באמצעות IFN-γ ELISA
איור 4. לתפקד ציטוטוקסיות של vivo לשעבר מורחבת בתאי T עם שרשרת גאמא ציטוקינים נגד קרצינומה של העכבר Neu חיובי החלב (MMC) תאים סרטניים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הרחבת סלקטיבי של גידולים בתאי T-reactive עם פונקציה אנטי הגידול מפעיל יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בפרוטוקול המוצע B / אני הפעלה והרחבה vivo לשעבר עם שרשרת גאמא ציטוקינים IL-2, IL-7 ו IL-15. בעוד IL-2 הוא תא T גורם הצמיחה שיכול לתמוך הבידול וההתרחבות של אנטיגן ספציפי בתאי T, IL-7 יכול לעכב אפופטוזיס של תאים T ותמיכה הכדאיות שלהם במהלך התרחבות. IL-15 T יכול לתמוך בזיכרון תאים חשובים להפקת לטווח ארוך אנטי הגידול התגובות על טיפול המאמצת תא T 9-11. שינוי הסדר ועל שילוב של ציטוקינים אלה יכולים להשפיע על התמיינות של תאים T מורחבת אשר בתורו עשוי לשפר או להפחית 12 אנטי הגידול שלהם יעילות. הפרוטוקול המוצע לא ידרוש זיהוי של אנטיגנים סרטניים. הרחבת סלקטיבי של הגידול T-reactive תוצאות תאים בייצור של מספרים גבוהים של אנטי הגידול ותאי T, שניתן להשתמש בהם לטיפול המאמצת תא T של חולי סרטן. הראינו בעבר כי vivo לשעבר מורחבת בתאי T בעלי חיים מוגנים מפני סרטן השד לאחר טיפול המאמצת תא T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 CA104757 גרנט (MH Manjili). בהכרת תודה אנו מכירים את התמיכה של VCU מאסי לחקר הסרטן וקרן העמים לחקר הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
