Summary
Un protocollo efficiente per la
Abstract
E 'stato riferito che i pazienti con cancro al seno hanno una risposta immunitaria preesistente contro i 1,2 tumori. Tuttavia, tali risposte immunitarie non riescono a fornire protezione completa contro lo sviluppo o la recidiva di cancro al seno. Per superare questo problema aumentando la frequenza del tumore cellule T reattive, immunoterapia adottiva è stato impiegato. Una varietà di protocolli sono stati utilizzati per l'espansione del tumore-specifica delle cellule T. Questi protocolli, tuttavia, sono limitati per l'utilizzo del tumore ex vivo antigeni per l'attivazione di antigene-specifiche cellule T. Molto recentemente, comune citochine gamma catena quali IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 sono stati utilizzati da soli o in combinazione per il miglioramento della risposta immunitaria anti-tumorale 3. Tuttavia, non è chiaro quale formulazione avrebbe funzionato meglio per l'espansione del tumore cellule T reattive. Qui vi presentiamo un protocollo per l'attivazione selettiva e l'espansione delle cellule T tumorali-reattiva dal modello FVBN202 topo transgenico di carcinoma mammario HER-2/neu positivo per l'uso in terapia cellulare adottiva T di cancro al seno. Il protocollo prevede l'attivazione di cellule T con bryostatin-1/ionomycin (B / I) e di IL-2, in assenza di antigeni tumorali per 16 ore. B / I di attivazione imita segnali intracellulari che comportano l'attivazione delle cellule T, aumentando l'attività della proteina chinasi C e calcio intracellulare, rispettivamente 4. Questo protocollo attiva specificamente tumore-specifica delle cellule T, mentre l'uccisione delle cellule T irrilevante. Il B / I-cellule T attivate sono in coltura con IL-7 e IL-15 per 24 ore e poi pulsato con IL-2. Dopo 24 ore, le cellule T sono lavati, divisi, e la coltura con IL-7 + IL-15 per ulteriori 4 giorni. Tumorali specificità e l'efficacia anti-tumorale della ex vivo delle cellule T espanse è determinata.
Protocol
1. Isolamento dei linfociti 5
- Isolare tumore-drenante linfonodi o milza di portatori di tumore FVBN202 topi transgenici e preparare sospensione singola cellula ghiacciato RPMI1640 supplementato con 10% FBS. B / I di attivazione in 50 ml in polipropilene risultati tubi conici in una maggiore produzione di cellule T rispetto ai tubi in polistirolo. Ketamina e xilazina vengono iniettati ip per l'anestesia. Dislocazione cervicale è utilizzato come metodo di eutanasia.
- Coltura delle cellule (10 6 cellule / ml) in terreno completo contenente 15% FBS con bryostatin-1 (5 nm) e ionomicina (1 mM) insieme a 80 U / mL di IL-2 (Peprotech) per 16 h.
- Lavare le cellule tre volte con mezzo caldo (37 ° C) e la cultura a 10 6 cellule / ml in terreno completo con IL-7 (10 ng / ml) e IL-15 (10 ng / ml) (Peprotech) per 24 ore .
- Pulse le cellule con IL-2 (40 U / mL) per 24 h.
- Dividere le celle e la cultura con IL-7 e IL-15 (10 ng / ml) per 4 giorni. Cambiamenti a medio e dividere le celle, se necessario, ogni 2 giorni.
2. Determinare espansione Fold delle cellule T dai conti cellulare e Citometria a flusso Analisi 5
- Conta delle cellule al microscopio ottico
- Preparare la diluizione appropriata di cellule (1:100) in trypan blu e aggiungere alcuni microlitri su emocitometro
- Conte 9 quadrati e determinare il numero totale delle cellule dividendo conta delle cellule al numero di camere moltiplicato per il fattore di diluizione. I risultati saranno presenti numero x 10 4 cellule / ml.
- Determinare percentuale di CD8 + e cellule T CD4 + nelle cellule espanse mediante citometria di flusso
- Blocca legame non specifico degli anticorpi ai recettori Fc dalla coltura le cellule con anticorpi anti-CD16/CD32 (Biolegend) per 20 minuti in ghiaccio e poi lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS ghiacciato integrato con sodio azide 1% .
- Macchiare le cellule da coltura con FITC-CD4 e CD8 PE-anticorpi per 20 minuti in ghiaccio e poi lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS ghiacciato integrato con FBS 1% e sodio azide allo 0,1%.
- Fissare le cellule con 1% paraformaldeide ed eseguire campioni su un Beckman Coulter FC 500 e analizzare con la versione 4,3 vertice del software.
3. Determinare Tumore specificità del Vivo ex Expanded cellule T
- Cultura della ex vivo ampliato linfociti in terreno completo con un rapporto 10:1 con irradiati neu positivo cellule tumorali MMC (15.000 rad) per 24 h. 5
- Surnatanti raccolta e conservare a -80 ° C fino al momento. 5,6
- Rileva IFN-γ utilizzando un mouse IFN-γ ELISA set (BD Pharmingen) secondo il protocollo del produttore. 5,6
4. Determinare antitumorale Funzione dell'ex Vivo Expanded cellule T 5,6
- Incubare cellule T con le cellule tumorali in un effettore 10:01: rapporti bersaglio per 48 ore in terreno completo a 3 ml di mezzo completo (RPMI-1640 integrato con 100 U / mL di penicillina, 100μg / ml streptomicina, 10% FBS, glutammina e β - mercaptoetanolo) e 20U / mL di IL-2 (Peprotech) in 6 piatti cultura ben 37 ° C / 5% di CO 2.
- Eseguire tre macchie di colore per gli anticorpi neu (anti-c-Erb2/c-neu, clone-4, Calbiochem) seguito da PE-anti IgG di topo, annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI), secondo il protocollo del produttore (BD Pharmingen)
- Porta sulle cellule tumorali neu positivo e analizzare la vitalità (annessina V-/PI-) delle cellule tumorali
5. Modello murino di cancro al seno
FVBN202 topi transgenici femminile (Charles River Laboratories) può essere utilizzato per la fonte del tumore cellule T reattive. Questi topi iperespressione di uno disattivo ratto neu transgene sotto il controllo del promotore MMTV e di conseguenza lo sviluppo spontaneo di carcinoma mammario tra i 4-10 mesi di età 7. Questi topi sviluppano premaligne iperplasia mammaria simile al carcinoma duttale in situ (DCIS) prima dello sviluppo della spontanea carcinoma8. Spontanea del tumore-cuscinetto topi sono usati come donatori di cellule T.
6. Rappresentante dei risultati:
Attivazione delle cellule T con B / I per 16 ore in risultati uccisione di cellule T naive che non sono sensibilizzati con il tumore in vivo. Dopo la B / I selettività di tumore cellule T reattive si espandono fino a 2,8 volte all'interno di un 6 giorni di cultura con citochine catena gamma (Figura 1). Entrambi i CD8 + e cellule T CD4 + sono ugualmente ampliata con citochine catena gamma (Figura 2). L'ex-vivo delle cellule T espanse mostrare reattività alta contro i tumori che i topi sono stati sensibilizzati al donatore, come valutato dalla produzione di IFN-γ in presenza di carcinoma mammario positivo del mouse neu (MMC), le cellule tumorali (Figura 3). L'ex vivo delle cellule T espanse può indurre l'apoptosi in positivo tumore cel neu MMCls tale che la vitalità delle cellule tumorali scende dal 92% al 61% entro 48 ore (Figura 4).
Figura 1. Fold espansione dei linfociti in diversi momenti seguenti B / I di attivazione (giorno 1) ed espansione ex vivo con citochine catena gamma (giorni 3, 5 e 7)
Figura 2. Percentuale totale di cellule CD4 + e CD8 + T prima e dopo 7 giorni di espansione con citochine catena di gamma.
Figura 3. Tumore stimolata la produzione di IFN-γ da parte delle cellule T isolate da topi portatori di tumore prima e dopo 7 giorni di espansione con citochine catena di gamma, con IFN-γ ELISA
Figura 4. Citotossici funzione della ex vivo delle cellule T espanse con citochine catena gamma del mouse neu contro il carcinoma mammario positivo (MMC), le cellule tumorali
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Discussion
Espansione selettiva del tumore-reattiva cellule T effettrici con funzione anti-tumorale può essere ottenuto utilizzando il protocollo proposto B / I di attivazione ed espansione ex vivo con citochine catena gamma di IL-2, IL-7 e IL-15. Mentre IL-2 è un fattore di crescita delle cellule T in grado di supportare la differenziazione e l'espansione di antigene-specifiche cellule T, IL-7 in grado di inibire l'apoptosi delle cellule T e sostenere la loro vitalità durante l'espansione. IL-15 può supportare le cellule T memoria che sono importanti per la generazione di lunga durata anti-tumore risposte sulla terapia cellulare adottiva T 9-11. Cambiando l'ordine e la combinazione di queste citochine potrebbero influenzare la differenziazione delle cellule T espanse che a loro volta possono migliorare o ridurre il loro anti-tumorali 12 efficacia. Il protocollo proposto non richiede l'identificazione di antigeni tumorali. Espansione selettiva del tumore cellule T reattive risultati nella produzione di un numero elevato di anti-tumorale delle cellule T che possono essere utilizzati per la terapia cellulare adottiva T dei pazienti oncologici. Abbiamo precedentemente dimostrato che la ex vivo delle cellule T espanse animali protetti contro il cancro al seno dopo la terapia cellulare adottiva T.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno della VCU Massey Cancer Center e della Fondazione del Commonwealth per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
