Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

doi: 10.3791/2381 Published: January 14, 2011

Summary

에 대한 효율적인 프로토콜

Abstract

이것은 유방암 환자들은 종양의 1,2에 대한 기존의 면역 반응을보고했다. 그러나, 이러한 면역 반응은 유방암의 개발이나 재발에 대한 완벽한 보호를 제공하기 위해 실패합니다. 종양 반응 T 세포의 빈도를 증가하여이 문제를 극복하기 위해 입양 immunotherapy가 채용되었습니다. 프로토콜의 다양한 종양 관련 T 세포의 확장을 위해 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은, 그러나, 항원에 특정한 T 세포의 활성화를위한 종양 항원의 전의 생체내의 사용을 제한하고 있습니다. 아주 최근에, 이러한 IL - 2, IL - 7, IL - 15, IL - 21과 같은 일반 감마 체인 크린 시토킨는 안티 종양 면역 반응 3의 강화를 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되었습니다. 그러나 제제는 종양 반응 T 세포의 확장에 가장 적합한 것이 무엇인지에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 여기서 우리는 선택 활성화 및 유방암의 입양 T 세포 치료에 사용하기 위해 HER-2/neu 양성 유방 암종의 FVBN202 유전자 변형 마우스 모델에서 종양 반응 T 세포의 확장을위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 16 시간 동안 종양 항원의 부재에서 bryostatin-1/ionomycin (B / I)와 IL - 2와 T 세포의 활성화를 포함하고 있습니다. B / I 활성화 세포내 신호를 모방 것을 각각 4, 단백질 키나제 C의 활동과 세포 내 칼슘을 증가시켜 T 세포 활성화의 결과. 없는 T 세포를 죽이는 동안이 프로토콜은 특히 종양 특정 T 세포를 활성화한다. B / I - 활성 T 세포는 24 시간 동안 IL - 7과 IL - 15과 교양 그리고 IL - 2 펄스입니다. 24 시간 후에, T 세포가와 분할을 씻어하고, 양식 아르 IL - 7 + 추가 4 일간 IL - 15. 전 생체내 확대 T 세포의 종양 - 특이성 및 안티 종양 효능이 결정됩니다.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Lymphocytes 5 분리

  1. 격리 종양 - 배수 림프절이나 종양 - 베어링 FVBN202 유전자 변형 생쥐의 spleens과 얼음처럼 차가운 RPMI1640에서 단일 세포 현탁액을 준비 10 % FBS와 함께 보충. 큰 T 세포 수율 50 - ML 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 결과에서 B / I 활성화 폴리스티렌 튜브에 비해. 마취제와 Xylazine는 마취에 대한 IP를 주입하고 있습니다. 자궁 경부 전위는 안락사의 방법으로 사용됩니다.
  2. 문화 16 H.에 대한 IL - 2 (Peprotech) 80 U / ML과 함께 bryostatin - 1 (5 NM)와 ionomycin (1 μm의)와 15% FBS를 포함하는 완전한 매체 전지 (10 6 세포 / ML)
  3. 24 H에 대한 IL - 7 (10 NG / ML)와 IL - 15 (10 NG / ML) (Peprotech)와 완전한 매체 10 6 세포 / ML에서 따뜻한 매체 (37 ° C)와 문화 셀에 세 번 씻어 .
  4. 24 H.에 대한 IL - 2 (40 U / ML)와 세포 펄스
  5. 4 일간 IL - 7과 IL - 15 세포와 문화를 (10 NG / ML) 분할. 매체 변경 2 일마다 필요한 경우 세포를 분리.

2. 셀 카운트 및 유동세포계측법 분석 5 T 세포의 폴드 확장 결정

  1. 가벼운 현미경으로 세포 카운트
    1. trypan 파란색으로 적절한 세포 희석 (1:100)을 준비하고 hemocytometer로 몇 μL를 추가
    2. 9 사각형을 계산하고 희석 계수를 곱한 챔버의 숫자로 셀 계산을 나누어 총 휴대폰 번호를 확인합니다. 결과는 숫자 X 10 4 셀 / ML를 제공합니다.
  2. 유동세포계측법하여 확장 세포의 CD8 +와 CD4 + T 세포의 비율을 결정
    1. 얼음 20 분 anti-CD16/CD32 항체 (Biolegend)과 culturing에 의해 FC 수용체에 항체가 아닌 특정 바인딩 세포를 차단하고 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML있는 셀에 두 번 씻어 1 %의 나트륨 azide와 보충 .
    2. 얼음 20 분 FITC - CD4 및 CD8 PE - 항체와 culturing하여 세포를 얼룩 후 1% FBS와 0.1 %의 나트륨 azide와 보충 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML있는 셀에 두 번 씻는다.
    3. 1 % paraformaldehyde로 세포를 고정하고 베크맨 쿨터 FC 500 샘플을 실행하고 서밋 버전 4.3 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.

3. 예 VIVO의 종양 - 특이성 결정 T 세포를 확대

  1. 문화 예 생체내 24 H. 5 반구 뉴 긍정 MMC 종양 세포와 10시 1분 비율 (15,000 방사선)에서 완전한 매체 lymphocytes 확대
  2. 사용하기 전까지 -80 ° C에서 수확 supernatants 및 저장합니다. 5,6
  3. 검색 IFN - γ 제조 업체의 프로토콜에 따라 마우스 IFN - γ 엘리사 세트 (BD Pharmingen)를 사용합니다. 5,6

4. 전 VIVO 확장 T 셀 5,6의 안티 종양 기능을 결정

  1. 3 ML 전체 매체 (RPMI - 1640 페니실린의 100U / ML, 100μg / ML 스트렙토 마이신, 글루타민 및 β 10% FBS와 보충에 완전한 매체 48 시간 동안 대상 비율 : 10시 1분 이펙터에 종양 세포와 함께 품어 T 세포 - 메르 캅 토 에탄올) 6 잘 문화 요리 37 ° C / 5 % CO 2에서 IL - 2 (Peprotech)의 20U / ML.
  2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 PE - 방지 마우스 IgG, Annexin V - FITC와 Propidium의 이우 (PI) (BD Pharmingen) 다음 뉴 세 컬러 항체 얼룩 (anti-c-Erb2/c-neu, 클론 - 4, Calbiochem)을 수행
  3. 종양 세포의 뉴 긍정적인 종양 세포에서 게이트 및 분석 생존 (Annexin V-/PI-)

5. 유방암의 마우스 모델

FVBN202 형질 여성 생쥐 (찰스 리버 연구소)는 종양 반응 T 세포의 출처에 사용될 수 있습니다. 이 마우스는 MMTV업자의 규정에 따라 unactivated 쥐 뉴 transgene을 overexpress 그 결과 연령 7 40~10개월 간의 자발적인 내유 암종을 개발합니다. 이 마우스는 자연 carcinoma8 개발하기 전에 원래의 장소에 ductal 암종 (DCIS)과 비슷 premalignant 내유 증식을 개발합니다. 자발적인 종양 - 베어링 생쥐는 T 세포의 기증자으로 사용됩니다.

6. 대표 결과 :

생체내에있는 종양에 sensitized 없습니다 나이브 T 세포의 살해 16 시간 결과에 대한 B / I와 T 세포의 활성화. 그들은 감마 체인 크린 시토킨 (그림 1)과 함께 6 일 문화 이내에 2.8 배까지 확대 종양 반응 T 세포의 B / I 선택성 후. CD8 +와 CD4 + T 세포가 균일하게 감마 체인 크린 시토킨 (그림 2)로 확장되는 모두. 전 생체내 - 확장 T 세포는 뉴 긍정적인 마우스 내유 암종 (MMC) 종양 세포 (그림 3)의 면전에서 IFN - γ의 생산에 의해 평가 등 기증자 쥐가에 sensitized다고 종양에 대한 높은 반응을 보여줍니다. 전 생체내는 확장 T 세포는 뉴 긍정 MMC 종양의 셀에 apoptosis을 일으킬 수종양 세포의 생존과 같은 것을인가 92 %에서 48 시간 이내 61% (그림 4) 방울.

누락된 그림
그림 1. B / I 활성화 (1 일) 및 감마 체인 크린 시토킨로 전직 생체내 확장 (일 3, 5, 7) 다음과 같은 서로 다른 시간 시점에서 lymphocytes의 폴드 확장

누락된 그림
그림 2. CD4 +와 CD8 + T 세포의 총 비율 전에 감마 체인 크린 시토킨와 함께 7 일 이후에 확장.

누락된 그림
그림 3. IFN - γ를 사용하기 전에 감마 체인 크린 시토킨와 함께 7 일 확장과 후 종양 베어링 생쥐에서 분리된 T 세포에 의해 생산, IFN - γ 엘리사 종양 자극

누락된 그림
그림 4. 뉴 긍정적인 마우스 내유 암종 (MMC) 종양 세포에 대한 감마 체인 크린 시토킨와 T 세포를 확장 전 생체내 세포 독성의 기능

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

효과기 안티 종양 기능으로 종양 반응 T 세포의 선택적 확장은 B를 사용하여 제안된 프로토콜에 의해 얻을 수있는 I / 활성화 및 감마 체인 크린 시토킨 IL - 2, IL - 7과 IL - 15 예 생체내 확장. IL - 2 항원에 특정한 T 세포의 분화와 확장을 지원할 수 T 세포 성장 인자이지만, IL - 7은 T 세포의 apoptosis를 억제하고 확장하는 동안 그들의 생존을 지원할 수 있습니다. IL - 15은 T 세포 입양 요법 9-11시 장기적인 안티 종양 응답을 생성하기위한 중요한 메모리 T 세포를 지원할 수 있습니다. 이러한 크린 시토킨의 순서와 조합을 변경하면 차례로 자신의 안티 종양의 효능 12 개선하거나 줄일 수있는 확장 T 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있습니다. 제안된 프로토콜은 종양 항원의 확인을 필요로하지 않습니다. 암 환자의 T 세포 입양 치료에 사용할 수있는 안티 종양 T 세포의 높은 숫자의 생산에 종양 반응 T 세포 결과의 선택적 확장. 우리는 이전에 전 생체내는 입양 T 세포 치료 다음과 같은 유방암에 대한 T 세포에게 보호 동물을 확대하는 것으로 나타났습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH R01 CA104757 그랜트 (MH Manjili)에 의해 지원되었다. 우리는 기꺼이 VCU 메시 암 센터의 지원과 암 연구에 대한 연방 재단 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bryostatin 1 Sigma-Aldrich B7431-10ug
Ionomycin Calbiochem 407950
Mouse IL-7 PeproTech Inc 217-17
Mouse IL-15 PeproTech Inc 210-15
Human IL-2 PeproTech Inc 200-02
RPMI1640 Invitrogen 11875
FBS Gemini Bio Products 100-106
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
L- glutamine Invitrogen 25030081
β- mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522
anti-CD16/32 antibody Biolegend 101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit BD Biosciences 556547
FITC-CD4 Biolegend 100406
PE-CD8 Biolegend 100708
anti-c-Erb2/c–Neu Calbiochem OP16
PE- anti mouse IgG Biolegend 405307
formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Hemocytometer Hycor 87144
Light microscope VWR international V200073
Mouse IFN-γ ELISA set BD Biosciences 555138
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T <em>세포의 생체내 전 확장</em> 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).More

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter