Summary
نحن هنا تصف استراتيجية فعالة لإزالة الغدد المنتجة للحرير من بطن امرأة عناكب الأرملة السوداء. هذا الإجراء يسمح للعزلة السريع للانتاج الحرير seven متميزة الغدد بطريقة عالي النقاء ، وهي عملية هامة للمحققين يدرسون العنكبوت إنتاج الحرير والتجمع الألياف.
Abstract
العناكب الحديثة تدور ألياف الحرير عالية الأداء مع طائفة واسعة من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك تنقل التقاط الفريسة ، وحماية النامية 1،2 ذرية. العناكب إنجاز هذه المهام من خلال الدوران عدة أنواع الألياف التي لها خصائص مميزة الميكانيكية المختلفة. لقد حدث مثل هذا التخصص من أنواع الألياف من خلال تطور غدد الحرير المنتجة المختلفة ، والتي تؤدي وظيفة وbiofactories الصغيرة. وهذه صناعة biofactories تخزين كميات كبيرة من البروتينات الحرير لإنتاج الألياف. من خلال سلسلة معقدة من الأحداث البيوكيميائية ، يتم تحويل هذه البروتينات الحرير من السائل إلى مادة صلبة عند قذف.
وقد أثبتت الدراسات الميكانيكية التي الحرير العنكبوت أقوى من الفولاذ عالي الشد 3. وقد كشفت التحاليل لفهم العلاقة بين بنية ووظيفة المواضيع التي حرير العنكبوت عنكبوت الحرير تتألف في معظمها من البروتينات ، أو fibroins ، التي يكرر كتلة ضمن تسلسل البروتين 4. ويجري كشف التوقيعات الجزيئية المشتركة التي تساهم في قوة الشد والتمدد لا يصدق من الحرير العنكبوت من خلال تحليلات cDNAs الحرير ترجمتها. نظرا للخصائص المواد غير عادية من الحرير العنكبوت ، ومختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم تتسابق على فهم ومحاكاة عملية الغزل لإنتاج ألياف الحرير الاصطناعي للاستخدامات التجارية والعسكرية والصناعية. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه صناعة الغزل الاصطناعي حرير العنكبوت في مختبر البحوث ينطوي على فهم كامل للعمليات الكيميائية الحيوية التي تحدث أثناء قذف من الألياف من الغدد المنتجة للحرير.
هنا نقدم وسيلة لعزل السبع الحرير المنتجة للغدد مختلفة من عنكبوت الأرملة السوداء cobweaving ، والذي يتضمن الغدد أمبولي الشكل الرئيسية والثانوية 7 [dragline بتصنيع الحرير والسقالات] 5،6 ، tubuliform [البيض يجمع الحرير القضية] ، 8 ، سوطي الشكل [وظيفة معروفة في الكوز ، النساجين] ، الإجمالية [يجعل الغراء الحرير] ، عنيبي الشكل [التفاف فريسة يجمع البيض والمواضيع القضية] (9) والكمثري [تنتج الحرير القرص المرفق] (10). ويستند هذا النهج على التخدير العنكبوت مع غاز ثاني أكسيد الكربون ، وفصل لاحق من cephalothorax من البطن ، وmicrodissection من البطن للحصول على الغدد المنتجة للحرير. بعد انفصال في الغدد المنتجة للحرير مختلفة ، يمكن استخدام هذه الأنسجة لاسترداد الجزيئات المختلفة للتحاليل الكيميائية الحيوية المتميزة ، بما في ذلك في الوقت الحقيقي PCR الكمي ، شمال وغرب النشاف ، ويحلل الطيف الكتلي (MS أو MS / MS) لتحديد سلاسل بروتين الحرير الجديد ، والبحث عن البروتينات التي تشارك في مسار التجمع الحرير ، أو استخدام أنسجة سليمة للثقافة الخلية أو التجارب النسيجية.
Protocol
1. التخدير العنكبوت والعزلة من البطن
- نقل العنكبوت من وعاء زجاجي داخل صندوق من الورق المقوى مبطنة بالبلاستيك (الشكل 1A). نحن عادة جمع العناكب من المرائب ، الحطب أو الشجيرات وإيوائهم في مختبر في وعاء زجاجي. لأن العنكبوت لا يمكن أن يتسلق بطانة من البلاستيك ، فإنه يوفر وسيلة فعالة لنقل العنكبوت من وعاء زجاجي أو القهوة يمكن في قارورة صغيرة لأغراض التخدير. أثناء التعامل مع العنكبوت في هذه النقطة ، يجب أن تكون على ارتداء اثنين من أزواج من القفازات المطاطية أو قفازات البستنة لأغراض السلامة.
- في حين أن العنكبوت في المربع مبطنة بالبلاستيك ، والنهج العنكبوت من المؤخر ، والسماح للعنكبوت الشريحة في قنينة بلاستيكية الثقافة. بعد عنكبوت يدخل القارورة ، ومكان على الفور المكونات عبر أعلى (1B الشكل). ونحن نوصي باستخدام قارورة أن ما يقرب من 101.6 ملم × 31.75 ملم (الطول × D). هذا يقلل من كمية غاز ثاني أكسيد الكربون اللازمة لخطوة التخدير.
- تخدير العنكبوت من خلال إدخال غاز ثاني أكسيد الكربون في 50-10 جنيه لكل بوصة مربعة لمدة 10 دقيقة (الشكل 1C). وهذه الكمية من الغاز تدق فقط من أصل نحو العنكبوت 5 دقائق ، وذلك بعد التخدير يجب الشروع فورا في خطوات 1،4-1،5.
- مكان العنكبوت تخدير في طبق تشريح الصغيرة واستخدام ملقط لوضع ما يصل العنكبوت الجانب الظهري (الساعة الرملية الحمراء أسفل).
- مقطع عنيقة (القصبة الضيقة التي تربط cephalothorax والبطن) للافراج عن بطنه من بقية العنكبوت (1D الشكل). cephalothorax تخزين في الثلاجة ليلة في صحن بتري وبعد تجاهل المجمدة في اليوم التالي. كن حذرا عند نقل cephalothorax مثل الأنياب للعنكبوت موجودة على هذا الجزء.
- ربط البطن للمواد Sylgard في صحن صغير به تشريح الحشرات دبوس واحد. إدراج دبوس الحشرات من خلال ثقب مصنوعة من قطع ساق (الشكل 1E). ويمكن بسهولة أن يكون هذا على النحو المحدد في الموقع حيث السائل يخرج من لقطة للساق. تأكد من مغزال (الطرف المقابل من ساق) هو التوجه نحو القاع (أقرب إليك).
2. إزالة الهيكل الخارجي
- جعل شق الأولى من خلال الهيكل الخارجي باستخدام زوج من microscissors ، بدءا من ثقب في لقطة ساق. قطع أفقيا حتى يتم الوصول إلى الجانب الظهري على كلا الجانبين (الشكل 1F). باستخدام زوج من الملقط ، قشر يعود الجزء الأمامي الهيكل الخارجي وادخال دبوس الثانية في هذا الموقع. بعد إدخال رقم التعريف الشخصي PIN الثاني ، بدوره علبة تشريح caudally (90 درجة زاوية) من التخفيضات الجانبي الأولي ويستمر القطع حتى يتم الوصول إلى المغازل (الشكل 1G). وسوف يكون هذا شق عمودي أو عمودي لقطع الجانبي الأولي. لا قطع طريق المغازل عندما يتم إجراء شق عمودي (النسبية الخلفي لالرملية ولها مظهر التعميم). وفشل لادخال دبوس second النتيجة في البطن الغزل عندما يتم تنفيذ الشقوق الرأسية.
- يغرق في تشريح البطن حل العازلة (كلوريد الصوديوم 0.1 M ، السيترات الصوديوم 0.015 M ، 0.1 ٪ ثنائي إثيل Pyrocarbonate).
- قشر الباقين ابتداء من الهيكل الخارجي مرة أخرى من شق الأولية الجانبية. عندما يتم الانتهاء من ذلك ، ينبغي أن الأنسجة الدهنية تكون مرئية بشكل واضح (الشكل 1H).
3. العزلة في الغدد المنتجة للحرير
- تبدأ باستخدام الملقط إغاظة بعيدا طبقة الدهون (الشكل 1H). وسوف يكون من الدهون إلى ظهور اللون الأبيض المصفر. تستمر حتى تتم إزالة معظم الدهون والغدد الحريرية مرئية بوضوح. الغدة tubuliform يتكون من ثلاثة أزواج من أنابيب اسطوانية طويلة جدا التي هي وفرة في تجويف البطن. وأمبولي الشكل الكبرى ، التي وجدت في أزواج ، هو كبير أمبولة الهلال ، مع شكل ذيل طويل ملتف القاصي والداني أن القناة النقصان في العرض وهي تقترب المغازل العنكبوت. وأمبولي الشكل بسيطة هي مشابهة جدا في التشكل على أمبولي الشكل الرئيسي ، ولكنه أصغر بكثير. الغدة سوطي الشكل ، وتحدث أيضا في أزواج ، ومستديرة ، ومتعدد الفصيصات مع أسطوانية التعرج الذي يمتد أسفل القناة تجاه المغازل. الغدة الكلي (وجدت في أزواج) هو كبير جدا ، والغدة متعدد الفصيصات يحتوي على القناة المفرغة كبيرة جدا والتي لها علاقات واسعة ، فصوص غير منتظمة على ذلك. عنيبي الشكل الغدد تحدث بأعداد كبيرة وتشبه قصيرة ، والإسقاطات الأصابع الصغيرة. الغدة الكمثري هي أصغر غدة في البطن ، والعديد من ضغط وقنوات الاسطوانية التي تشبه المروحة مع العديد من القنوات الصغيرة المفرغة التي تمتد وصولا الى المغازل.
- نوصي إزالة الغدد في الترتيب التالي : tubuliform ، أمبولي الشكل الكبرى ، سوطي الشكل ، أمبولي الشكل طفيفة ، الكلي ، عنيبي الشكل ، ثم الكمثري (الشكل 2A - B).
- بداية مع tubuliform ، ندف هذه الغدد الخروج من بقية الالغدد ه -- يجب أن تكون جالسا على قمة الغدد الأخرى (الشكل 2A). هناك ثلاثة أزواج من الغدد tubuliform في عنكبوت واحد. السماح لهم تعويم حرة ولكنها تظل مرتبطة المغازل من خلال القنوات الخاصة بهم.
- المقبل ، ندف بعيدا الغدد أمبولي الشكل الرئيسية. هناك نوعان من الغدد أمبولي الشكل الرئيسية الموجودة في أحد العنكبوت. أثناء إجراء الفك ، تأكد من القنوات لا تزال تعلق على الغدد (الشكل 2A).
- تواصل ندف بقية الغدد بعيدا عن بعضها البعض ، والعمل بعناية لتجنب أي ثقب في الغدد ، وخصوصا الكلي والغدد سوطي الشكل. وينبغي أن يكون حرا في كل غدة عائمة على طول الطريق إلى نقطة الخروج في الهيكل الخارجي للالمغازل. كما تم العثور على هذه الغدد في أزواج. إزالة كل معسر الغدة بواسطة ملقط مع القناة وسحب بعناية حتى يبتعد عن نقطة الخروج. تم العثور على أمبولي الشكل الكبرى ، سوطي الشكل ، أمبولي الشكل طفيفة ، والغدد التجميعية في أزواج. الغدد عنيبي الشكل الكمثري وتحدث في العديد من أزواج.
- إزالة كل معسر الغدة بواسطة ملقط مع القناة وسحب بعناية حتى يبتعد عن نقطة الخروج من أسفل مغزال. نحن عادة تخزين الرطب في الغدد ، ومع ذلك ، فإننا لا تضيف عازلة إضافية.
- كما تتم إزالة الغدد ووضعها معقمة قبل المسمى أنابيب 1.5 مل microcentrifuge. وتظهر في الشكل الفردية الغدد 3A - G. إبقاء هذه الغدد على الجليد ثم فلاش تجميدها في النيتروجين السائل. بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل ، ووضعهم في -80 درجة مئوية للتخزين.
4. ممثل النتائج
عند إزالة الغدد المختلفة ، ينبغي اتخاذ الحذر الشديد أثناء التعامل مع سوطي الشكل الكلي والغدد ، كما يمكن أن هذين الهيكلين ثقب بسهولة وتلف مع ملقط. وعلاوة على ذلك ، فمن الجدير بالذكر أن شكليا الغدد سوطي الشكل الكلي وتبدو متشابهة للغاية قبل إزالتها ، وغالبا ما تتشابك مع بعضها البعض. لمنع التلوث عبر هذه الأنسجة على الإزالة ، وينبغي للمشرح ندف بعناية هذه الهياكل إربا. بالإضافة إلى ذلك ، عند التعرض لها في الغدد المنتجة للحرير ، والغدد عنيبي الشكل الكمثري ويكون أكثر صعوبة في تصور على الفور نظرا لصغر حجم وموقعها التشريحي. غالبا ما هناك هو وجود الكثير من البيض. وعلاوة على ذلك ، والرعاية إضافية يلزم اتخاذها عند إزالة الغدة كمثري الشكل ، وهذا النسيج هو لزجة جدا وغالبا ما ستلتزم ملقط الخاص. عندما يتم هذا الإجراء بشكل صحيح ، فمن الممكن الحصول على الحرير السبعة جميعهم من الغدد المنتجة للعنكبوت واحد بطريقة عالي النقاء. عادة ، يمكن للمرء استرداد كميات ميكروغرام من الحمض النووي الريبي والبروتينات الكلية من تشريح العنكبوت واحد. ويرد مثال باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع qPCR لدراسة مستويات مرنا من الجينات tubuliform فبروين المقيدة ، TuSp1 ، (الشكل 4). التجارب التي تنطوي على ممثل lysates جمعت من البروتين في الغدد مثلا في محلول الهضم تريبسيني تليها تحليل MS (يمكن أن تستخدم أيضا لMS / MS تحليل) أو تكوين الأحماض الأمينية التحليل هو موضح (الشكل 5-6 ، على التوالي).
الشكل 1. المناولة والتخدير ، والتخلص من الهيكل الخارجي من بطن عنكبوت الأرملة السوداء الإناث. أ) نقل العنكبوت في صندوق من الورق المقوى مبطنة بالبلاستيك لتسهيل نقل العنكبوت إلى قارورة صغيرة من البلاستيك. ب) وضع العنكبوت إلى قارورة من البلاستيك مع المكونات. C) التخدير العنكبوت مع غاز ثاني أكسيد الكربون. D) الفصل بين cephalothorax من البطن باستخدام microscissors. E) استيقاف من البطن في علبة تشريح باستخدام دبابيس الحشرات. F) عرض بعد إجراء شق الوحشي مع مقص ، وجزء من الهيكل الخارجي ودقت مرة بالملقط. G) التي تبذل لخفض عمودي الشقوق الجانبي الأولي. H) إزالة الهيكل الخارجي والتعرض للطبقة الدهون.
الشكل 2. التصور في الغدد المنتجة للحرير seven مختلفة بينما سليمة في بطن العنكبوت فضلا عن الأنسجة المحيطة بها. أ) صور من tubuliform ، أمبولي الشكل الكبرى ، سوطي الشكل والركام ، والأنسجة أمبولي الشكل طفيفة في التكبير 12X. ب) صورة للغدد عنيبي الشكل الكمثري والتكبير في 12X.
الشكل 3. فوتوغرافية للغدد الحرير المنتجة السبعة بعد ازالتها من البطن. تم القبض على جميع الصور في 20X التكبير مع استثناء من عنيبي الشكل الكمثري والغدد ، والتي كانت تتم في 40X. والكبرى)أمبولي الشكل غدة ؛ B) أمبولي الشكل الرئيسية والثانوية (الجانب الأيمن) للمقارنة حجم ؛ C) tubuliform ؛ D) سوطي الشكل ؛ E) الكلي ؛ F) عنيبي الشكل ؛ G) الكمثري.
النتائج الممثل الشكل 4. نمط التعبير عن الجينات الحرير ، TuSp1 ، بعد مسح مستويات TuSp1 مرنا في الغدد المنتجة للحرير المختلفة (باستثناء الغدة الكمثري) باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (qPCR) العزلة التالية من الحمض النووي الريبي من مجموع الغدد.
الشكل 5. مثال لتحليل MS مقتطفات من البروتين الحصول عليها من غدة كمثري الشكل التالي في محلول الهضم زيتية. ملاحظة : 2 - X2 يمثل أضعاف التكبير كثافة الطيف. وترد جماهير الطيف ايون الببتيد التي تتوافق مع مناطق فبروين PySp1 مع الرمز #.
الشكل 6. نتيجة نموذجي من الأحماض الأمينية تكوين البروتينات المستخرجة من الغدة tubuliform. ملاحظة : ASX = ASP والأسباراجين ؛ = GLX حمض الغلوتاميك وGLN. تلوين الزرقاء يعكس الأحماض الأمينية القطبية مع الجماعات سلسلة الجانب حين تلون أحمر يمثل بقايا الأحماض الأمينية مع المنظمات غير القطبية مجموعات سلسلة جانبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
منهجيتنا لmicrodissection في الغدد المنتجة للحرير العنكبوت من الأرملة السوداء يوفر وسيلة فعالة للحصول على الحرير عالي النقاء لانتاج الغدد. يمكن أن تكتمل في تشريح 1،5-3 ساعات ، مما أسفر عن مجموعة كاملة من السبعة المتميزة الحرير المنتجة من الغدد cobweavers. الحصول على الحرير عالي النقاء الغدة عينات يسمح للمحققين القدرة على أداء مجموعة واسعة من الدراسات البيوكيميائية ، بما في ذلك تحديد من الحرير الجديد أو البروتينات كوصي المخزنة داخل محتويات اللمعية غدي باستخدام مطياف الكتلة ، وتحليل مستويات مرنا وأعرب عن الجينات بشكل انتقائي في الغدد المختلفة وزراعة الغدد محددة في المختبر لدراسة آلية إنتاج الحرير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال توصيف NSF المنح RUI MCB - 0950372 الجزيئية يحق للعنكبوت الأرملة السوداء الحرائر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0.1 M in water |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0.015 M in water |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
References
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
