Summary
Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie, um die Seide produzierenden Drüsen aus dem Bauch der weiblichen Schwarzen Witwen zu entfernen. Dieses Verfahren ermöglicht die schnelle Trennung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen in hochreiner Mode, ein wichtiger Prozess für die Ermittler Studium Spinnenseide Produktion und Faserverbund.
Abstract
Moderne Spinnen High-Performance-Seidenfasern mit einer breiten Palette von biologischen Funktionen, einschließlich Fortbewegung, Beutefang und zum Schutz der Entwicklung der Nachkommen 1,2. Spiders diese Aufgaben durch Spinnen mehrere verschiedene Fasertypen, dass diverse mechanische Eigenschaften aufweisen. Eine solche Spezialisierung der Fasertypen hat durch die Entwicklung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, die als kleine Biofabrik Funktion aufgetreten ist. Diese Biofabrik Herstellung und Lagerung von großen Mengen von Seidenproteinen für Faserproduktion. Durch eine komplexe Reihe von biochemischen Vorgängen, sind diese Seidenproteine von einer Flüssigkeit in einem festen Material nach der Extrusion umgewandelt.
Mechanische Untersuchungen haben gezeigt, dass Spinnenseide stärker als hochfestem Stahl 3 sind. Analysen, um die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion der Spinnenseide Themen verstehen haben ergeben, dass Spinnenseide zum größten Teil aus Proteinen oder Fibroine, dass Block wiederholt haben im Rahmen ihrer Proteinsequenzen 4 besteht. Gemeinsame molekulare Signaturen, die die unglaubliche Zugfestigkeit und Dehnbarkeit von Spinnenseide beitragen werden durch die Analysen der übersetzten Seide cDNAs entwirrt. Angesichts der außergewöhnlichen Materialeigenschaften von Spinnenseide sind Forschungslabors auf der ganzen Welt Rennen zu verstehen und zu imitieren das Spinnverfahren für synthetische Seidenfasern für kommerzielle, militärische und industrielle Anwendungen. Eine der größten Herausforderungen für die Spinnerei künstliche Spinnenseide im Forschungslabor beinhaltet ein vollständiges Verständnis der biochemischen Prozesse, die während der Extrusion der Fasern von der Seiden-produzierenden Drüsen auftreten.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von den sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus der cobweaving Schwarze Witwe, die die großen und kleinen Ampullendrüse Drüsen enthält [fertigt dragline und Gerüste Seide] 5,6, tubuliform [synthetisiert Eihülle Seide] 7 , 8, flagelliform [unbekannter Funktion in cob-Weber], aggregieren [macht Leim Seide], aciniform [synthetisiert Beute Verpackung und Eihülle Themen] 9 und birnenförmig [produziert Befestigung Disc Seide] 10. Dieser Ansatz basiert auf betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas, anschließende Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch, und Mikrodissektion des Bauches, die Seiden-produzierenden Drüsen zu erhalten basiert. Nach der Trennung der verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, können diese Gewebe verwendet, um verschiedene Makromoleküle für verschiedene biochemische Analysen, einschließlich der quantitativen real-time PCR, Northern-und Western-Blot analysiert Massenspektrometrie (MS oder MS / MS) zu identifizieren abgerufen werden New Silk Protein-Sequenzen, Suche nach Proteinen, die in die Seide Montage Weg zu beteiligen, oder verwenden Sie das intakte Gewebe für die Zellkultur oder histologische Untersuchungen.
Protocol
1. Betäubende die Spinne und die Isolierung des Bauches
- Übertragen Sie die Spinne aus einem Glas in einem Karton mit Kunststoff (Abbildung 1A) ausgekleidet. Wir sammeln in der Regel Spinnen aus Holzstapel, Garagen oder Büsche und Haus sie im Labor in Gläsern. Da die Spinne nicht klettern kann die Kunststoff-Futter, bietet es eine effiziente Methode, um die Spinne aus einem Glas oder Kaffee können Transfer in ein kleineres Gefäß für Anästhesie Zwecke. Beim Umgang mit der Spinne an diesem Punkt, sollten Sie das Tragen von zwei Paar Latex-Handschuhe oder Gartenhandschuhe aus Gründen der Sicherheit.
- Während die Spinne ist in der Box mit Kunststoff ausgekleidet, nähern sich die Spinne von der Rückseite und lassen Sie die Spinne Abgleiten in die Kunststoff-Flasche Kultur. Nach der Spinne in die Flasche, sofort den Stecker over the top (Abbildung 1B). Wir empfehlen die Verwendung eines Fläschchens, dass etwa 101,6 mm x 31,75 mm (L x D) ist. Dies minimiert die Menge an Kohlendioxid für die Betäubung Schritt nötig.
- Anesthetize die Spinne durch die Einführung von Kohlendioxid-Gas bei 5-10 Pfund pro Quadratzoll für 10 min (Abbildung 1C). Diese Gasmenge wird nur klopfen die Spinne für rund 5 min, so dass nach Betäubung müssen Sie sofort Schritte 1,4-1,5 gehen.
- Setzen Sie den narkotisierten Spinne in einen kleinen Dissektion Schüssel und Verwendung einer Pinzette, um die Spinne Rückenseite nach oben (rote Sanduhr nach unten) positionieren.
- Clip der Stiel (schmale Stiel Anschluss des Cephalothorax und das Abdomen), um den Bauch aus dem Rest der Spinne (Abbildung 1D) freizugeben. Bewahren Sie den Cephalothorax in der Tiefkühltruhe über Nacht in einer Petrischale und entsorgen nach gefrorenen am nächsten Tag. Seien Sie vorsichtig beim Bewegen der Cephalothorax wie die Zähne der Spinne präsentieren in diesem Segment sind.
- Befestigen Sie den Bauch, um die Sylgard Material in den kleinen Dissektion Schüssel mit einem einzigen Insekten pin. Legen Sie das Insekt Stift durch das Loch aus dem Blütenstiel Clipping (Abb. 1E) gemacht. Dies kann leicht als der Ort, wo die Flüssigkeit aus dem Clipping des Stiels Schwellenländern identifiziert werden. Sicherstellen, dass die Düse (entgegengesetzten Ende des Stiels) ist nach unten orientiert (am nächsten zu Ihnen).
2. Die Entfernung des Exoskelett
- Sprechen Sie die erste Schnitt durch das Exoskelett mit einem Paar Mikroschere, beginnend mit dem Loch aus dem Blütenstiel Clipping. Cut seitlich bis zur Dorsalseite auf beiden Seiten (Abb. 1F) erreicht wird. Mit einer Pinzette, Ziehen Sie die vordere Exoskelett Segment und fügen Sie einen zweiten Stift an dieser Stelle. Nach dem Einlegen der zweiten Stift, drehen Sie das Sezieren Tablett kaudal (90 °-Winkel) von der ersten seitlichen Schnitten und weiter schneiden, bis die Düsen erreicht werden (Abbildung 1G). Dieser Schnitt wird senkrecht oder vertikal sein, um die ersten seitlichen Schnitt. Nicht durch die Düsen, wenn der vertikale Schnitt gemacht wird (posterior gegenüber dem Sanduhr und es hat einen kreisförmigen Aussehen) geschnitten. Nichtbeachtung der zweiten Stifteinsatz wird in den Bauch drehen, wenn die vertikale Schnitte durchgeführt werden, führen.
- Tauchen Sie den Bauch in Sezieren Puffer-Lösung (0,1 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, 0,1% Diethylpyrocarbonat).
- Peel die restlichen Exoskelett wieder ab dem ersten, seitlichen Einschnitt. Wenn dies abgeschlossen ist, sollte das Fettgewebe deutlich sichtbar (Abbildung 1H).
3. Die Isolierung der Seiden-produzierenden Drüsen
- Mit einer Pinzette beginnen Hänseleien entfernt die Fettschicht (Abbildung 1H). Das Fett hat eine weißliche bis gelbliche Erscheinung. Fahren Sie bis das meiste Fett wird entfernt und die Spinndrüsen sind deutlich sichtbar. Die tubuliform Drüse besteht aus drei Paaren von sehr langen, zylindrischen Röhren, die reichlich in der Bauchhöhle sind. Die großen Ampullendrüse, die paarweise gefunden wird, ist eine große, halbmondförmige Ampulle mit einem langen gewundenen distalen Schwanz und einem proximalen Kanal, der in der Breite abnimmt, wie es der Spinne Spinndüsen Ansätze. Die kleine Ampullendrüse ist sehr ähnlich in Morphologie der großen Ampullendrüse, aber es ist deutlich kleiner. Die flagelliform Drüse, auch auftreten in Paaren, ist rund und multilobular mit einem kleinen zylindrischen Zick-Zack-Kanal, der nach unten erstreckt auf die Spinndüsen. Das Aggregat Drüse (gefunden in Paaren) ist ein sehr großes, multilobular Drüse, die eine sehr große Ausführungsgang, die große, unregelmäßige Lappen hat auf sie hat. Die aciniform Drüsen kommen in großer Zahl und ähneln kurze, kleine fingerlike Projektionen. Die birnenförmig Drüse ist die kleinste Drüse in der Bauchhöhle und hat viele verdichtet, zylindrischen Kanäle, die ein Fan mit vielen kleinen Ausführungsgänge, die bis hinab zu den Spinndüsen ähneln.
- Wir empfehlen, die Drüsen in der folgenden Reihenfolge: tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse, aggregieren aciniform, und dann die birnenförmig (Abbildung 2A-B).
- Beginnend mit dem tubuliform, necken diese Drüsen aus der übrigen the Drüsen - sie sollten auf der anderen Drüsen (Abbildung 2A) zu sitzen. Es gibt drei Paare von tubuliform Drüsen in einer einzigen Spinne. Lassen Sie sie zu schweben frei, sondern bleiben an ihren Spinnwarzen durch ihre Leitungen.
- Next, necken sich die großen Ampullendrüse Drüsen. Es gibt zwei große Ampullendrüse Drüsen in einer Spinne. Während das Verfahren zur Entfernung sicher, dass die Leitungen verbunden bleiben die Drüsen (Abbildung 2A).
- Fahren Sie mit dem Rest der Drüsen von einander entfernt zu necken, arbeiten sorgfältig, so dass jeder Punktion der Drüsen, vor allem das Aggregat und flagelliform Drüsen. Jede Drüse sollte frei schwimmenden alle den Weg zu seinem Ausgangspunkt in das Exoskelett der Spinndüsen. Diese Drüsen sind auch paarweise gefunden. Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er von der Ausfahrt entfernt Pointbreaks. Die großen Ampullendrüse, flagelliform, kleinere Ampullendrüse und aggregieren Drüsen sind in Paaren gefunden. Die aciniform und birnenförmig Drüsen kommen in vielen mehr Paare.
- Entfernen Sie jede Drüse durch Einklemmen des Kanals mit einer Pinzette und vorsichtiges Ziehen, bis er bricht, die Ausfahrt nach unten durch die Düse. Wir in der Regel speichern die Drüsen nass, aber wir wissen nicht zusätzliche Puffer.
- Da die Drüsen entfernt werden, legen Sie sie in sterile pre-markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Individuelle Drüsen sind in Abbildung 3A-G gezeigt. Bewahren Sie diese Drüsen auf Eis und dann Flash-frieren sie in flüssigem Stickstoff. Nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff, legen Sie sie bei -80 ° C für die Lagerung.
4. Repräsentative Ergebnisse
Beim Entfernen der verschiedenen Drüsen, sollten extreme Vorsicht walten beim Umgang mit dem flagelliform und aggregieren Drüsen werden, da diese beiden Strukturen leicht durchstoßen werden können und beschädigt mit der Zange. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass morphologisch die flagelliform und aggregieren Drüsen sehr ähnlich vor ihrer Entfernung betrachten und sie sind oft miteinander verwoben. Um zu verhindern Kreuzkontamination dieser Gewebe bei der Entnahme sollte das Dissektor sorgfältig tease diese Strukturen auseinander. Außerdem auf der ersten Exposition der Seiden-produzierenden Drüsen, die aciniform und birnenförmig Drüsen der schwierigsten sofort visualisieren aufgrund ihrer geringeren Größe und anatomische Lage sein. Oft gibt es die Anwesenheit von vielen Eiern. Darüber hinaus muss zusätzlich darauf geachtet werden, beim Entfernen des birnenförmig Drüse werden, da dieses Gewebe ist extrem klebrig und wird oft zu Ihrem Zange halten. Wenn dieses Verfahren richtig gemacht wird, ist es möglich, alle sieben Seide produzierenden Drüsen von einer einzigen Spinne in hochreiner Form zu erhalten. In der Regel kann man wieder Mikrogramm-Mengen von Gesamt-RNA und Protein aus einer einzigen Spinne Dissektion. Ein Beispiel für die Verwendung der Gesamt-RNA für die qPCR zum mRNA-Spiegel einer tubuliform beschränkt Fibroin Gen, TuSp1 zu untersuchen, wird angezeigt (Abbildung 4). Vertreter Experimente, die an Protein aus den Drüsen Lysaten gesammelt beinhalten z. B. in-Lösung tryptischen Verdauung durch MS-Analyse (könnte auch für MS / MS-Analyse verwendet werden) oder eine Aminosäure-Zusammensetzung Analyse wird angezeigt (Abbildung 5-6, jeweils) gefolgt.
Abbildung 1. Handling, betäuben, und die Entfernung des Exoskelett aus dem Bauch einer weiblichen Spinne der schwarzen Witwe. A) Transfer von der Spinne in einem Karton mit Kunststoff ausgekleidet, um zu erleichtern bewegt die Spinne in einen kleineren Kunststoff-Fläschchen. B) Spider platziert in eine Kunststoff-Flasche mit Stecker. C) betäuben die Spinne mit Kohlendioxid-Gas. D) Die Trennung der Cephalothorax aus dem Bauch mit Mikroschere. E) Immobilisierung des Bauches in der Anatomie Tablett mit Insekten Pins. F) anzeigen nach einem seitlichen Einschnitt mit der Schere und ein Teil des Exoskelett ist zurück mit einer Pinzette geschält wird. G) Einschnitte senkrecht zur ersten seitlichen Schnitt. H) Die Entfernung der Exoskelett und Exposition der Fettschicht.
Abbildung 2. Visualisierung der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen, während intakte in den Bauch der Spinne sowie das umgebende Gewebe. A) Bilder von der tubuliform, großen Ampullendrüse, flagelliform, aggregieren kleinere Ampullendrüse Gewebe mit 12facher Vergrößerung. B) Bild des aciniform und birnenförmig Drüsen mit 12facher Vergrößerung.
Abbildung 3. Photographs der sieben Seide produzierenden Drüsen nach ihrer Entnahme aus dem Bauch. Alle Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung mit Ausnahme der aciniform und birnenförmig Drüsen, die bei 40x getan wurden gefangen genommen. A) großenAmpullendrüse; B) Dur-und Moll Ampullendrüse (rechts) zum Größenvergleich; C) tubuliform; D) flagelliform; E)-Aggregat; F) aciniform; G) birnenförmig.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse des Expressionsmusters der Seide Gen, TuSp1 nach Vermessung der TuSp1 mRNA-Spiegel in den verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen (mit Ausnahme der birnenförmig Drüse) mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) nach der Isolierung von Gesamt-RNA aus die Drüsen.
Abbildung 5. Beispiel von MS-Analyse von Protein-Extrakten aus der birnenförmig Drüse folgenden in-Lösung tryptischen Verdau erhalten. Hinweis: x2 für 2-fache Vergrößerung des Spektrums Intensität. Spectrum Peptid-Ionen-Massen, die Regionen der PySp1 Fibroin entsprechen, sind mit dem Symbol # angezeigt.
Abbildung 6. Typisches Ergebnis der Aminosäure-Zusammensetzung Profil der Proteine aus dem tubuliform Drüse extrahiert. Hinweis: ASX = Asp und Asn; GLX = Glu und Gln. Blaufärbung zeigt Aminosäuren mit polaren Seitenkette Gruppen während rote Färbung stellt Aminosäurereste mit unpolaren Seitenkette Gruppen.
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Discussion
Unsere Methodik für die Mikrodissektion der Seiden-produzierenden Drüsen aus der schwarzen Witwe bietet ein wirksames Mittel zu hoch gereinigten Seide produzierenden Drüsen zu erhalten. Dissektionen können in 1,5 bis 3 Stunden abgeschlossen sein, was zu einem kompletten Satz der sieben verschiedenen Seiden-produzierenden Drüsen aus cobweavers. Beziehen hochgereinigtes Seide-Drüse Proben ermöglicht Forschern die Möglichkeit, ein breites Spektrum an biochemischen Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung von neuen Seide oder Chaperon-Proteine innerhalb der Drüsen luminalen Inhalte mit Hilfe der Massenspektrometrie, die Analyse der mRNA-Spiegel für Gene selektiv ausgedrückt in verschiedenen Drüsen gespeichert durchführen und Kultivierung spezieller Drüsen in vitro, um den Mechanismus der Seidenproduktion zu studieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium NSF RUI MCB-0950372 mit dem Titel Molekulare Charakterisierung von Black Widow Spinnenseidenproteinen unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0.1 M in water |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0.015 M in water |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
References
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