Microdissection av Black Widow Spider Silk-körtlar

Summary

Här beskriver vi en effektiv strategi för att ta bort siden-producerande körtlar från buken av kvinnliga svarta änkan. Detta förfarande möjliggör en snabb isolering av de sju olika siden-körtlar i en mycket renat mode, en viktig process för utredarna att studera spindeltråd produktion och fiber montering.

Abstract

Moderna spindlar spin högpresterande siden fibrer med ett brett utbud av biologiska funktioner, inklusive förflyttning, rov fånga och skydd för att utveckla avkomma ^1,2. Spindlar utföra dessa uppgifter genom att snurra flera olika fibertyper som har olika mekaniska egenskaper. En sådan specialisering av fibertyper har skett genom utvecklingen av olika siden-körtlar, som fungerar som små biofactories. Dessa biofactories tillverka och lagra stora mängder silkesproteiner för fiberproduktion. Genom en komplex serie av biokemiska händelser, dessa silkesproteiner omvandlas från en vätska i ett fast material vid extrudering.

Mekaniska studier har visat att spindeln silke är starkare än höghållfast stål ^3. Analyser för att förstå förhållandet mellan struktur och funktion spindeltråd trådar har visat att spindeltråd stor del består av proteiner, eller fibroins, som blockerar upprepar inom sina proteinsekvenser ^4. Vanliga molekylära signaturer som bidrar till den otroliga draghållfasthet och töjbarhet av spindel siden är repas genom analyser av översatta siden cDNAs. Med tanke på de extraordinära materialegenskaper av spindel silke, finns forskningslaboratorier över hela världen racing att förstå och efterlikna spinnprocess att producera syntetiskt silke fibrer för kommersiella, militära och industriella applikationer. En av de största utmaningarna för spinning konstgjord spindeltråd i forskningen labbet innebär en fullständig förståelse av de biokemiska processer som sker under extrudering av fibrer från silke-producerande körtlar.

Här presenterar vi en metod för isolering av de sju olika siden-producerande körtlar från cobweaving svarta änkan spindel, vilket inkluderar större och mindre ampullate körtlar [tillverkar Kran och byggnadsställningar siden] ^5,6, tubuliform [syntetiserar ägg fall silke] ^{7 , 8,} flagelliform [okänd funktion i cob-väverskor], sammanlagt [gör lim siden] aciniform [syntetiserar bytesdjur inslagning och ägg trådar fall] ⁹ och päronformade [producerar bifogad skiva siden] ^10. Detta synsätt bygger på anesthetizing spindeln med koldioxid, efter avskiljandet av cephalothorax från buken och microdissection av buken för att få silke-producerande körtlar. Efter separation av de olika siden-producerande körtlar, kan dessa vävnader användas för att hämta olika makromolekyler för olika biokemiska analyser, inklusive kvantitativa realtids-PCR, norra-och västra blotting, masspektrometri (MS eller MS / MS) analyser för att identifiera New Silk protein-sekvenser, söka efter proteiner som deltar i siden montering väg, eller använd intakt vävnad för cellodling eller histologiska experiment.

Protocol

1. Anesthetizing spindeln och isolering av buken

1. Överför spindel från en glasburk i en kartong bäddad med plast (Figur 1A). Vi samlar vanligen spindlar från vedstaplarna, garage eller buskar och hus dem i labbet i glasburkar. Eftersom spindeln inte kan klättra upp plasten foder, ger det en effektiv metod att överföra spindel från en glasburk eller kaffe kan till en mindre flaska för anesthetizing ändamål. Vid hantering av spindeln i detta läge bör du vara klädd två par latexhandskar eller handskar trädgårdsarbete av säkerhetsskäl.
2. Medan spindeln är i lådan fodrad med plast, tillvägagångssätt spindeln från baksidan och låt spindeln glida in i plasten kulturen flaskan. Efter spindel kommer in i flaskan, omedelbart placera kontakten over the top (Figur 1B). Vi rekommenderar att du använder en flaska som är ungefär 101,6 mm x 31,75 mm (L x D). Detta minimerar den mängd koldioxid som behövs för anesthetizing steg.
3. Bedöva spindeln genom att introducera gasen koldioxid på 5-10 pounds per kvadrattum i 10 min (Figur 1C). Denna mängd gas kommer bara att slå spindeln ut för ca 5 min, så efter anesthetization du måste omedelbart gå vidare till steg 1,4-1,5.
4. Placera sövs spindeln i en liten dissektion skålen och använda pincett för att positionera spindeln ryggsidan uppåt (röd timglas nedåt).
5. Kläm pedicel (smal stjälk ansluter cephalothorax och buken) för att frigöra buken från resten av spindeln (figur 1D). Förvara cephalothorax i frysen över natten i en petriskål och kassera efter frusna nästa dag. Var försiktig när du flyttar cephalothorax som huggtänder av Spider finns på detta segment.
6. Fäst buken till Sylgard materialet i den lilla dissektion skålen med en enda insekt stift. Sätt insekten stiftet genom hålet görs från pedicel klippning (Figur 1E). Detta kan lätt identifieras som den plats där vätskan är på väg från klippning av pedicel. Se till att spinndysor (motsatta änden av pedicel) är riktad mot botten (närmast dig).

2. Borttagning av exoskelett

1. Gör det första snittet genom exoskelett hjälp av ett par microscissors, med början vid hålet från pedicel klippning. Skär i sidled tills ryggsidan nås på båda sidor (Figur 1F). Med hjälp av en pincett, skala tillbaka den främre exoskelett segmentet och mata in en andra stift på denna plats. Efter införandet av den andra stift, vrid dissekera fack caudally (90 ° vinkel) från den initiala laterala snitt och fortsätter skära tills Spinnerets uppnås (figur 1G). Detta snitt kommer vara vinkelrät eller vertikala den ursprungliga laterala snitt. Skär inte igenom Spinnerets När den vertikala snitt görs (bakre förhållande till timglaset och den har ett cirkulärt utseende). Underlåtenhet att infoga den andra stift kommer att resultera i buken snurra när den vertikala snitt utförs.
2. Sänk buken i dissekera buffertlösning (0,1 M natriumklorid, 0,015 M natriumcitrat, 0,1% dietyl Pyrocarbonate).
3. Skala resterande exoskelett tillbaka med början från den ursprungliga, laterala snitt. När detta är klart ska fettvävnad synas tydligt (Figur 1H).

3. Isolering av siden-producerande körtlar

1. Använd pincett börjar reta bort fettlager (Figur 1H). Fettet har en vitaktig till gulaktig utseende. Fortsätt tills det mesta av fettet tas bort och silke körtlar syns tydligt. Den tubuliform körteln består av tre par mycket långa, cylindriska rör som finns rikligt i bukhålan. Den stora ampullate, som finns i par, är en stor, halvmåneformade ampulla med en lång invecklad distala svans och en proximal kanal som minskar i bredd när den närmar sig spindelns Spinnerets. Den mindre ampullate är mycket likartad i morfologi till de stora ampullate, men det är betydligt mindre. Den flagelliform körtel, som också förekommer i par, är rund och multilobular med en liten cylindrisk sicksack-kanal som sträcker sig ner mot Spinnerets. Den sammanlagda körtel (finns i par) är en mycket stor, multilobular körtel som har en mycket stor utskiljningskanal som har stora, oregelbundna lober på den. Den aciniform körtlar förekommer i stort antal och liknar korta, små fingerlike prognoser. Den päronformade körtel är den minsta körtel i buken och har många komprimerade, cylindriska kanaler som påminner om en fläkt med många små utsöndringsorganen kanaler som sträcker sig ner till Spinnerets.
2. Vi rekommenderar att ta bort de körtlar i följande ordning: tubuliform, större ampullate, flagelliform, mindre ampullate, aggregat, aciniform, och sedan det päronformade (Figur 2A-B).
3. Från och med tubuliform, retas dessa körtlar bort av resten av the körtlar - de ska sitta på toppen av andra körtlar (Figur 2A). Det finns tre par tubuliform körtlar i en enda spindel. Låt dem flyta fritt, men sitter kvar på sina Spinnerets av sina kanaler.
4. Därefter retas bort de stora ampullate körtlar. Det finns två stora ampullate körtlar som finns i en spindel. Under borttagningsproceduren, se till att kanalerna finns kvar på den körtlar (Figur 2A).
5. Fortsätt att retas resten av körtlar bort från varandra, arbetar noggrant för att undvika att punktera någon av de körtlar, särskilt aggregat och flagelliform körtlar. Varje körtel bör vara fritt flytande ända till dess utgång i exoskelett till Spinnerets. Dessa körtlar finns också i par. Ta bort varje körtel genom att klämma i kanalen med pincett och försiktigt dra tills den lossnar från utförselstället. De stora ampullate, flagelliform, mindre ampullate och samlade körtlar finns i par. Den aciniform och päronformade körtlar förekommer i många fler par.
6. Ta bort varje körtel genom att klämma i kanalen med pincett och försiktigt dra tills den lossnar från utförselstället nere vid spinndysor. Vi lagrar vanligtvis körtlar våta, men vi behöver inte lägga till ytterligare buffert.
7. Som körtlar tas bort, placera dem i sterila pre-märkt 1,5 ml rör mikrocentrifug. Individuella körtlar visas i figur 3A-G. Förvara dessa körtlar på is och sedan blinka frysa dem i flytande kväve. Efter blixt frysning i flytande kväve, placera dem vid -80 ° C för förvaring.

4. Representativa resultat

När du tar bort olika körtlar, bör man vara extremt noga vid hantering av flagelliform och samlade körtlar, eftersom dessa två strukturer kan lätt punkteras och skadade med pincett. Dessutom är det värt att notera att morfologiskt den flagelliform och samlade körtlar ser väldigt lika innan de forslas bort och de är ofta sammanflätade med varandra. För att förhindra korskontaminering av dessa vävnader vid avlägsnande skall DISSEKTOR retas noggrant dessa strukturer isär. Dessutom, efter den initiala exponeringen av siden-producerande körtlar kommer aciniform och päronformade körtlarna vara det svåraste att omedelbart visualisera på grund av sin mindre storlek och anatomiska läge. Ofta finns det förekomsten av många ägg. Dessutom behöver ytterligare att vara försiktig när du tar bort det päronformade körtel, eftersom denna vävnad är mycket klibbig och kommer ofta följa din pincett. När detta förfarande är gjort på rätt sätt är det möjligt att få samtliga sju siden-producerande körtlar från en enda spindel i ett mycket rent sätt. Vanligtvis kan man återvinna mikrogram totala mängden RNA och protein från en enda spindel dissekering. Ett exempel på användning av den totala RNA för qPCR att undersöka mRNA nivåerna av en tubuliform begränsad fibroin gen, TuSp1, visas (Figur 4). Representant experiment som involverar protein lysates hämtas från körtlar t.ex. i-lösning Tryptic rötning följt av MS-analys (kan även användas för MS / MS-analys) eller en aminosyra sammansättning analysen (Figur 5-6, respektive).

Figur 1. Handling, anesthetizing och borttagning av exoskelett från buken av en kvinnlig svarta änkan spindel. A) överlåtelse av spindeln i en kartong bäddad med plast för att underlätta att flytta spindeln i ett mindre plast flaska. B) Spider placeras i en plast flaska med plugg. C) Anesthetizing spindeln med koldioxid. D) Separation av cephalothorax från buken med microscissors. E) fixering av buken i dissekera fack med hjälp av insekter stift. F) Visa efter ett lateralt snitt görs med sax och en del av exoskelett är ringde tillbaka med pincett. G) Snitt görs vinkelrätt mot det första laterala snitt. H) Borttagandet av exoskelett och exponering av fettlager.

Figur 2. Visualisering av sju olika siden-producerande körtlar obrutet i buken av Spider samt omgivande vävnader. A) Bilder på tubuliform, större ampullate, flagelliform, aggregat, mindre ampullate vävnader på 12X förstoring. B) Bild av aciniform och päronformade körtlar på 12X förstoring.

Figur 3. Fotografier av de sju siden-producerande körtlar efter de avlägsnas från buken. Alla bilder var tagna på 20X förstoring med undantag för aciniform och päronformade körtlar, som utfördes vid 40X. A) störreampullate körtel, B) större och mindre ampullate (höger sida) för storlek jämförelse, C) tubuliform, D) flagelliform, e) aggregatet, F) aciniform, g) päronformade.

Figur 4. Representativa resultat av uttrycket mönster i silke gen, TuSp1, efter kartläggning av TuSp1 mRNA nivåerna i olika siden-producerande körtlar (exklusive det päronformade körteln) med hjälp av kvantitativa realtids-PCR (qPCR) efter isolering av total RNA från körtlar.

Figur 5. Exempel på MS-analys av protein extrakt från det päronformade körtel följande i-lösning Tryptic matsmältningen. Obs: x2 representerar 2-faldig förstoring av spektrum intensitet. Spectrum peptid ion massor som motsvarar regioner i PySp1 fibroin visas med symbolen #.

Figur 6. Typiska resultat av AMINOSYRASAMMANSÄTTNING profil av proteinerna ur tubuliform körteln. OBS: ASX = Asp och ASN, GLX = Glu och GLN. Blåfärgning speglar aminosyror med polära grupper sidokedja medan röd färg representerar aminosyrarester med icke-polära grupper sidokedja.

Discussion

Vår metod för microdissection av siden-producerande körtlar från svarta änkan spindel erbjuder ett effektivt sätt att få mycket rent silke-producerande körtlar. Dissektioner kan fyllas i 1,5 till 3 timmar, vilket ger en komplett uppsättning av de sju olika siden-producerande körtlar från cobweavers. Att få mycket rent silke-körtel prov innebär utredarna förmågan att utföra ett brett spektrum av biokemiska studier, inklusive identifiering av nya siden eller proteiner förkläde lagras i glandulära luminala innehållet med hjälp av masspektrometri, analys av mRNA nivåer för gener selektivt uttrycks i olika körtlar och odling av specifika körtlar in vitro för att studera mekanismen för silke produktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm