Summary
Protocol beschrijft de toepassing van een flow cel-systeem voor de teelt en het analyseren van microbiële biofilms voor Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM).
Abstract
Veel microbiële cellen hebben het vermogen om ongesteeld microbiële gemeenschappen gedefinieerd als biofilms die fysiologische en pathologische eigenschappen te hebben veranderd in vergelijking met vrij levende micro-organismen te vormen. Biofilms in de natuur zijn vaak moeilijk te onderzoeken en te verblijven onder slecht gedefinieerde condities: 1. Met behulp van een transparant substraat is het mogelijk om het apparaat een systeem waar simpel biofilms kunnen in een niet-destructieve manier worden onderzocht in real-time: hier tonen we aan de montage en de werking van een flow cel modelsysteem, voor in vitro 3D-studies van microbiële biofilms het genereren van hoge reproduceerbaarheid onder goed gedefinieerde condities 2,3.
Het systeem bestaat uit een flow cel die dient als kamer voor de groei van biofilm. De stroom cel is voorzien van voedingsstoffen en zuurstof uit een medium fles via een peristaltische pomp en bracht medium wordt verzameld in een afvalcontainer. Deze constructie van de stroming systeem maakt een continue aanvoer van voedingsstoffen en de administratie van bijvoorbeeld antibiotica met een minimale verstoring van de cellen gekweekt in de stroom kamer. Bovendien is de stroom omstandigheden binnen de stroom cel laten studies van biofilm blootgesteld aan shear stress. Een bel trapping apparaat grenzen luchtbellen uit de slang, die anders kunnen de biofilm-structuur in de stroom cel verstoren.
De stroom cel systeem is compatibel met Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM) en kan daardoor bieden een zeer gedetailleerde 3D-informatie over het ontwikkelen van microbiële biofilms. Cellen in de biofilm kan worden gelabeld met een fluorescerende probes of eiwitten compatibel is met CLSM analyse. Dit maakt online visualisatie en maakt het mogelijk onderzoek naar niches in de ontwikkelingslanden biofilm. Microbiële samenhang, het onderzoek van antimicrobiële middelen of de expressie van specifieke genen, zijn van de vele experimentele opstellingen die kunnen worden onderzocht in de stroom cel systeem.
Protocol
1. Montage van de Flow Cell-systeem met alle componenten
De gemonteerde flow systeem omvat: autoclaveerbaar buizen, bel vallen, medium / afval fles en stroom cellen, zoals weergegeven in figuur 1. Al deze onderdelen kunnen worden hergebruikt tussen de experimenten.
Figuur 1. De stroom cel System Setup (essentiële componenten van de setup). De stroom cel systeem bestaat uit verschillende componenten: een medium fles, een peristaltische pomp, bel vallen, de stroom cel, een fles van afval, en diverse delen van buizen met elkaar verbonden door verschillende connectors. Figuur vriendelijk verschaft door Rune Lyngklip.
2. Montage van de Flow Cell
- De stroom cel (Figuur 2a) is behandeld met dunne rijstroken van siliconen lijm, met een injectiespuit (Figuur 3).
- Plaats een dekglas op de top van de silicone lijnen (Figuur 3). Glazen dekglaasjes worden gebruikt als substraat voor P. aeruginosa terwijl PVC dekglaasjes worden toegepast voor S. cerevisiae biofilm.
Figuur 2. Schematische tekening van stroom cel en opvanginrichting, 2. Gedetailleerde beschrijving van de dimensies gebruikt voor de productie van een) flow cel b) opvanginrichting, DTU Systems Biology. Overgenomen met toestemming van John Wiley & Sons, Inc (DTU Systems Biology was vroeger het recht BioCentrum, zoals weergegeven in de figuur)
Figuur 3. Illustratie van de silicone lijm applicatie lijnen voor de bevestiging van de glazen substraat. De aangegeven dekking van glas is geplaatst over de siliconen lijm om het te hechten aan de stroom cel.
- Zet de stroom cel over en plaats deze op een vlakke ondergrond met het deksel slip naar beneden. Druk zachtjes op de achterkant van de flow cel naar de dekglas op de bodem van de stroom cel duwen. Zet de stroom cel over en inspecteren voor gebieden die niet zijn verzegeld door de siliconen. Het handvat (zuiger) deel van een injectiespuit kan worden gebruikt als een hulpmiddel om voorzichtig samen te drukken het glas en de stroom cel.
3. Medium Fles
- Plaats een voeding siliconen buis (2 mm binnendiameter) in een medium fles en plaats een rechte connector aan de andere kant.
- Voeg medium om de fles (voor middelgrote inhoud te zien "media" paragraaf)
Cover-connector en een fles met metalen folie en autoclaaf het medium. Zorg ervoor dat het uiteinde van de levering buis is bevestigd boven het vloeistofniveau in het medium fles of een sifon effect kan leeg de fles bij het medium autoclaaf.
4. Aansluiten van de Bubble Trap, Flow Cell en Pump
Monteer alle leidingen volgens het schema in figuur 1. Gebruik silicone met uitzondering van het deel dat gaat door de peristaltische pomp waar Marprene slangen wordt toegepast.
- Met het oog op de buis sluiten van het medium fles alle individuele stromen kamers, verdeeld een slangetje in het vereiste aantal van inlaten toegepast in het experiment. Gebruik T-connectoren aan de wenselijke aantal aansluitleidingen maken van de feed buis om de Marprene buizen in de pomp (zie figuur 1, T-connector). Het is over het algemeen een goed idee om de dezelfde volgorde volgorde van buizen en flow cellen houden het hele systeem, om de identificatie van de componenten te vergemakkelijken in geval van storingen in het systeem.
- Sluit elke individuele sondevoeding (2 mm in diameter) aan buizen Marprene in de pomp met behulp van rechte connectoren. Sluit de Marprene slangen om een opvanginrichting (Figuur 2b) via tussenliggende silicone buis (1 mm in diameter). Zorg ervoor dat de pomp is aangesloten op de inlaat van de grootste deel van de opvanginrichting.
- Sluit de resulterende uitlaatbuis van de bel vallen om de stroom cel inlaat (1 mm in diameter), ervoor zorgen dat de lengte van deze leidingen kan de doorstroming cel die moet worden verplaatst naar de fase van de confocale microscoop (meestal 1 m).
- Plaats 5 ml spuiten op de top van de bubble vallen. Sluit de toppen met geschikte doppen.
- Op de stroom cel stopcontact aansluiten van een kort, ongeveer 40 mm stuk (1 mm in diameter), slangen en gebruik een "vermindering" straight connector om een afvalstof buis bevestigen (2 mm in diameter) van de benodigde lengte. Plaats afval buizen in de afval container.
- Belangrijk is, moet het afval container altijd geplaatst worden op hetzelfde niveau als de stroming cellen, nooit onder de flow-cell niveau. Zorg er ook voor dat het einde van het afval buis is bevestigd boven het verwachte niveau van afval vloeistof te spoelen-back te vermijden als gevolg van een sifon effect bij het hanteren van de stroom cellen.
5. STERILISEREN en wassen van de FLOW SYSTEEM
- Verwijder opvanginrichting, caps en plaats ze in 70% ethanol om ze steriel.
- Run op de hoogste snelheid van de pomp om het systeem te vullen met 0,5% (v / v) natriumhypochloriet in water. </ Li>
- Plaats de opvanginrichting doppen weer op wanneer de bubble vallen zijn volledig gevuld is.
- Tik op de stroom cellen om bellen te verwijderen in de flow kamer. Zorg ervoor dat u de fragiele te dekken glasschade.
- Laat het systeem voor 3-4 uur steriliseren bij een debiet van 3 ml / h / kanaal (0,2 mm / s lineaire flow rate).
- Was het systeem 2-3 keer te wassen alles uit de hypochloriet. Vullen en leeg het systeem met steriel water. Bubble vallen moeten volledig worden geleegd tussen elke wasbeurt. Dit kan worden gedaan door het pompen in de lucht tot de bel valkuilen zijn geleegd. Na het legen, Verwijder het kapje van de bel vallen voordat vullen van het systeem. Vervang caps nadat de bubble valkuilen zijn volledig gevuld met vloeistof. Herhalen als nodig is.
- Ren steriel water door het systeem op een lage stroomsnelheid (1-3 ml / h / kanaal) 's nachts of doorgaan naar de volgende stap.
- Sluit het medium fles naar de inlaat en spoel het systeem met medium 's nachts op een laag debiet (3 ml / h / kanaal) bij de temperatuur waarbij het experiment zal worden uitgevoerd. Opmerking: bubbel vallen moet worden geleegd voor water voordat het systeem is gevuld met medium.
6. Enten van de stroom cel
- Van een 's nachts cultuur maken een te verdunnen tot een gewenste optische dichtheid (voor P. aeruginosa bijvoorbeeld 0.001 OD 600 nm en 0,1 OD 600 nm voor S. cerevisiae).
- Gebruik een 0,5 ml spuit met een 27G naald om voldoende inoculum laden om de kamer te vullen. 250 ui is voldoende voor de stromingskamers met de afmetingen zoals aangegeven in dit werk (zie figuur 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm).
- Stop de peristaltische pomp.
- Klem van de siliconen slang leidt tot de stroom cel om te voorkomen terugstromen in het systeem.
- Steriliseer de inoculatie plaats op de siliconen slang schoon met 70% ethanol.
- Steek de naald in de siliconen tube en de invoering van de punt in de inlaat van de stroom cel. Injecteer langzaam het inoculum in de kamer (wees niet te luchtbellen injecteren).
- Verwijder de naald en veeg de injectieplaats met 70% ethanol gevolgd door onmiddellijke verzegeling van de hole met behulp van siliconen lijm op de injectieplaats.
- Draai de stroom cel en laat de micro-organismen zich te houden aan de ondergrond gedurende 1 uur zonder stroom door de stroom cel.
- Zet de stroom cel, start het medium pomp (3 ml / h / kanaal) en neem de klem van de siliconen tube.
- Het systeem is geplaatst voor incubatie, bij 37 ° C in het geval van P. aeruginosa en 30 ° C in het geval van S. cerevisiae.
- Biofilm in de stroom kamers kan nu worden gevisualiseerd door CLSM.
7. Kleuring van BIOFILM voor microscopie
- Maak een verdunning van de geschikte vlekken (bijv. 1:1000 SYTO 9 leven vlek voor S. cerevisiae)
- Stop de peristaltische pomp.
- Klem van de silicone slang die naar de stroom cel.
- Steriliseer beëntingsplaats op de siliconen slang schoon met 70% ethanol.
- Gebruik een 0,5 ml spuit met een 27G naald om genoeg kleuroplossing belasting op de kamer te vullen. 250 ui is voldoende voor de stroom kamers hier gebruikt.
- Steek de naald in de siliconen tube en de invoering van de punt in de inlaat van de stroom cel. Injecteer langzaam de kleuroplossing in de kamer (wees niet te bubbels injecteren).
- Verwijder de naald en veeg de injectieplaats met 70% ethanol gevolgd door onmiddellijke verzegeling van de plaats van injectie.
- Laat de stroom cel zonder stroom gedurende 15 minuten.
- Verwijder de klem en start de flow (3 ml / h / kanaal)
- Verwerven van gegevens met de CLSM
Discussion
We hebben aangetoond dat een flow cel systeem dat een krachtig instrument in de biofilm onderzoeken vertegenwoordigt. In combinatie met 3D-beeldvorming door confocale microscopie, het systeem heeft een bereik van voordelen ten opzichte van andere methoden voor het analyseren van microbiële biofilms door middel van meer traditionele microscopische technieken. Dit systeem maakt 3D-visualisatie van het leven microbiële biofilm gemeenschappen zonder verstoring van de gemeenschap. Lichtmicroscopie zal geen gedetailleerde informatie over de niches van de biofilm en terwijl elektronenmicroscopie biedt nanoschaal resolutie van de biofilm, het niet mogelijk live cell imaging.
Met behulp van de beschreven stromingskanaal systeem dat we eerder hebben toegelicht de ruimtelijke verdeling van de bacteriële cellen die gevoelig zijn voor meerdere antibiotica 5-8 (figuur 4a), de distributie van extracellulaire verbindingen, bijvoorbeeld DNA 9-11 en, de verdeling van beweeglijke en niet-beweeglijke cellen dezelfde soort binnen een bacteriële gemeenschap 4,6,9 (Figuur 4c). Wij voorzien dat de stroom cel systeem kan worden gebruikt om aspecten van gist biofilms te bestuderen. Dit kan de spatio temporele verdeling van gist biofilm in reactie op omgevingsfactoren zoals fungiciden, met een overzicht van de genen die betrokken zijn in gist biofilm ontwikkeling. Hoewel gist is niet bekend dat het differentiëren in beweeglijke en niet-beweeglijke cellen, kunnen andere aspecten van de biofilm diversificatie zijn studies, zoals de morfologische verschuiving van gist tot pseudohyfale cellen en de verschuiving van haploïde tot diploïde cellen.
We hebben laten zien een systeem dat voldoet aan een aantal microbiële species en zal werken met diverse kleuringen technieken. Een verscheidenheid van verschillende kleuren probes en fluorescerende eiwitten, zoals GFP, in staat stellen specifieke niche onderzoek in de ontwikkelingslanden biofilm en is een efficiënt hulpmiddel bij het analyseren van het effect van antimicrobiële middelen of andere omgevingsfactoren. De informatie die verkregen kan worden is zeer gedetailleerd (figuur 4) en functies in de biofilm kunnen worden gekwantificeerd met computerprogramma's zoals COMSTAT 12,13.
Over het geheel genomen het meest kritische aspect van het protocol is het feit dat het een tijdrovend proces. Het is ook een beperking die de cellen nodig hebben om te kunnen groeien op een niet-fluorescerende, transparante oppervlak. . Sindsdien de biofilm is geanalyseerd met behulp van een confocale microscoop, de diepte die kan worden onderzocht is beperkt tot een paar honderd micrometer 14 Er zijn nog meer technische beperkingen die inherent zijn aan het ontwerp: het systeem is niet geschikt voor high throughput screening, als een ervaren onderzoeker kan omgaan met ten hoogste ongeveer 15 kanalen per experiment, die op zijn beurt kan enkele dagen voor te bereiden. Echter, antibiotica of mutanten die worden beschouwd als relevant voor biofilm studies in eerste instantie massa gescreend met andere methoden, zoals crystal violet vlekken voor de meest interessante kandidaten worden overgebracht naar de stroom cel systeem. De cover glasplaten zijn erg dun en breken gemakkelijk, en de zorg moeten worden genomen bij het hanteren van de systemen. Naast de slang moet dagelijks worden onderzocht tijdens de run van een experiment, als een aanzienlijke "back-groei 'in de inlaat buizen net stroomopwaarts van de stroming cellen kunnen optreden. Deze besmetting kan worden opgelost door het verwijderen van enkele centimeters van siliconen buis van de inlaatzijde van de stroom cellen, met behulp van steriele techniek.
Figuur 4 a) 4 dagen oud PAO1 -. GFP biofilm behandeld voor 24 uur met Colistine en propidiumjodide voor dode vlekken (rode vlek), b), 3D-presentatie van een drie dagen oud P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa wild type) - GFP biofilm 6 c), 3D-foto presentatie van een PAO1 - GVB pila mutant (blauw) met een PAO1 wild type YFP (geel) d) 5 dagen oud PAO1 - GFP biofilm gepresenteerd als een 3D- foto e) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutant in CEN.PK achtergrond) biofilm gekleurd met SYTO-9 15.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
Tubing:
Media
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Growing and analyzing biofilms in flow cells. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).
- Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).
- Haagensen, J. A. Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).
- Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).
- Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes. Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).
- Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy. Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).
- Barken, K. B. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).
- Qin, Z. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Allesen-Holm, M. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
- COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: http://www.comstat.dk/ (2010).
- Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).
- Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).
