Summary
Protocole décrivant l'application d'un système de cellule à circulation pour la croissance et l'analyse des biofilms microbiens pour la microscopie confocale à balayage laser (CLSM).
Abstract
Beaucoup de cellules microbiennes ont la capacité de former des communautés microbiennes sessiles défini comme les biofilms qui ont modifié les propriétés physiologiques et pathologiques par rapport aux micro-organismes vivant en liberté. Les biofilms dans la nature sont souvent difficiles à étudier et résider sous peu les conditions définies 1. En utilisant un substrat transparent, il est possible d'appareil un système où les biofilms simples peuvent être examinées de manière non destructive en temps réel: ici nous montrer le montage et le fonctionnement d'un système modèle de flux de cellules, pour des études in vitro en 3D des biofilms microbiens générant une grande reproductibilité dans des conditions bien définies 2,3.
Le système se compose d'une cellule d'écoulement qui sert de chambre de croissance pour le biofilm. La cellule de débit est fourni avec les nutriments et l'oxygène à partir d'un flacon de support via une pompe péristaltique et moyennes passé est recueillie dans un conteneur à déchets. Cette construction du système d'écoulement permet un approvisionnement continu de nutriments et de l'administration d'antibiotiques par exemple avec une perturbation minimale des cellules cultivées dans la chambre d'écoulement. Par ailleurs, les conditions d'écoulement dans la cellule de flux permettent d'études du biofilm exposées à un stress de cisaillement. Une bulle de bulles d'air dispositif de confine de la tubulure qui, autrement, pourrait perturber la structure du biofilm dans la cellule d'écoulement.
Le système de pile est compatible avec les flux de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et peut ainsi offrir des informations très détaillées en 3D sur le développement des biofilms microbiens. Les cellules dans le biofilm peut être étiquetée avec des sondes fluorescentes ou des protéines compatibles avec l'analyse CLSM. Cela permet la visualisation en ligne et permet l'étude des niches dans le biofilm en développement. Interrelation microbiens, enquête sur les agents antimicrobiens ou l'expression de gènes spécifiques, sont des configurations de nombreuses expériences qui peuvent être étudiés dans le système de cellule d'écoulement.
Protocol
1. Assemblée du système de pile de débit avec tous les composants
Le système d'écoulement assemblés comprend: tube autoclavable, pièges à bulles, à moyen / déchets de bouteilles et de cellules d'écoulement comme le montre la figure 1. Toutes ces pièces peuvent être réutilisées entre les expériences.
Figure 1. La configuration du système de flux de cellules (des composantes essentielles de la configuration). Le système de pile de débit se compose de plusieurs éléments: une bouteille moyenne, une pompe péristaltique, pièges à bulles, la cellule d'écoulement, une bouteille de déchets, et diverses sections de tubes interconnectés par différents connecteurs. Figure aimablement fournies par Rune Lyngklip.
2. Assemblée de la cellule de flux
- La cellule d'écoulement (figure 2a) est traitée avec des voies mince de colle silicone, à l'aide d'une seringue (figure 3).
- Placer une lamelle sur le dessus des lignes de silicone (figure 3). Lamelles de verre sont utilisées comme substrat pour P. aeruginosa alors lamelles en PVC sont appliquées pour S. biofilm cerevisiae.
Figure 2. Schéma de la cellule de flux et 2 piège à bulles. Description détaillée des dimensions utilisées pour la production d'un piège) écoulement à bulles cellules B), DTU biologie des systèmes. Reproduit avec la permission de John Wiley & Sons, Inc (Systèmes DTU biologie était autrefois intitulée BioCentrum, comme illustré dans la figure)
Figure 3. Illustration des lignes de silicone à l'application de la colle pour la fixation du substrat de verre. Le couvercle en verre indiqué est placé sur la colle silicone pour l'attacher à la cellule d'écoulement.
- Tournez la cellule de flux et placez sur une surface plane avec le côté lamelle vers le bas. Appuyez doucement sur le dos de la cellule de flux de pousser la lamelle sur la base de la cellule de flux. Tournez la cellule de flux plus et inspecter des zones qui ne sont pas scellées par du silicone. La poignée (piston) partie d'une seringue peut être utilisée comme un outil pour appuyer légèrement sur la cellule de verre et coulent ensemble.
3. Bouteille Medium
- Placer un tube de silicone d'alimentation (2 mm de diamètre interne) dans une bouteille de moyen et insérer un connecteur direct à l'autre bout.
- Ajouter à moyen et à la bouteille (pour le contenu moyen voir "médias" du paragraphe)
Couverture connecteur et une bouteille avec une feuille de métal et autoclaver le milieu. Assurez-vous que l'extrémité du tube d'alimentation est fixé au-dessus du niveau de liquide dans la bouteille à moyen ou un effet de siphon peut vider la bouteille milieu lorsque l'autoclave.
4. Raccordement du piège à bulles flux de cellules, et la pompe
Assemblez tous les tubes selon le schéma de la figure 1. Utilisez tube en silicone, sauf pour la partie qui passe par la pompe péristaltique, où tube Marprene est appliquée.
- Afin de connecter le tube de la bouteille à moyen et à toutes les chambres d'écoulement individuelles, diviser un tube dans le nombre requis d'entrées appliqués à l'expérience. Utilisez des connecteurs en T pour faire le nombre souhaitable de tubes de raccordement du tube d'alimentation dans les tubes Marprene dans la pompe (voir la Figure 1, T-connecteur). Il est généralement une bonne idée de garder la même séquence afin de tubes et de cellules d'écoulement à travers le système, afin de faciliter l'identification des composants en cas de défauts dans le système.
- Connectez chaque tube d'alimentation individuelles (2 mm de diamètre) pour Marprène tubes de la pompe à l'aide de connecteurs droits. Branchez le tube Marprene à un piège à bulles (Figure 2b) via un tube de silicone intermédiaires (1 mm de diamètre). Assurez-vous que la pompe est reliée à l'admission à la partie la plus haute du piège à bulles.
- Connectez le tube de sortie résultant de l'pièges à bulles à l'entrée de la cellule de flux (1 mm de diamètre), assurez-vous que la longueur de ces tubes permet à la cellule de flux pour être déplacé à l'étape du microscope confocal (typiquement de 1 m).
- Placer 5 ml seringues sur le dessus du piège à bulles. Fermer les sommets avec des bouchons adaptés.
- A la sortie de cellule de flux de connecter un court, d'environ 40 mm de pièces (1 mm de diamètre), des tubes et utiliser une «réduction» connecteur droit d'attacher un tube de déchets (2 mm de diamètre) de la longueur nécessaire. Placer les tubes des déchets dans le conteneur à déchets.
- Fait important, le conteneur à déchets doit toujours être placé au même niveau que les cellules d'écoulement, jamais en dessous du débit-Level Cell. Aussi, assurez-vous que l'extrémité de la tubulure de déchets est fixée au-dessus du niveau attendu de déchets liquides pour éviter ras-retour en raison d'un effet de siphon lors de la manipulation des cellules de flux.
5. STERILISATION ET LAVAGE le système d'écoulement
- Retirer les bouchons piège à bulles et les placer dans de l'éthanol à 70% pour les garder stériles.
- Exécuter à plus grande vitesse de la pompe pour remplir le système avec 0,5% (v / v) d'hypochlorite de sodium dans l'eau. </ Li>
- Placer le piège à bulles bouchons de retour sur le moment où les pièges à bulles sont complètement remplis.
- Appuyez sur le flux de cellules pour éliminer les bulles dans la chambre d'écoulement. Prenez soin de ne pas endommager le couvercle en verre fragiles.
- Permettre au système de stérilisation pour les 3-4 h à un débit de 3 mL / h / canal (taux de 0,2 mm / s de débit linéaire).
- Laver le système 2-3 fois pour laver tous les hypochlorite. Remplir et vider le système avec de l'eau stérile. Bubble pièges doivent être vidés complètement entre chaque lavage. Cela peut être fait par pompage à l'air jusqu'à pièges à bulles ont été vidés. Après la vidange, enlever les bouchons des pièges à bulles avant de remplir le système. Remplacer bouchons après la bulle de pièges ont été complètement remplis de liquide. Répéter au besoin.
- Faites couler l'eau stérile à travers le système à un débit faible (1-3 ml / h / voie) pendant la nuit ou de procéder à l'étape suivante.
- Connecter la bouteille moyenne à l'entrée et à rincer le système avec des moyennes pendant la nuit à faible débit (3 ml / h / voie) à la température où l'expérience sera réalisée. Remarque: pièges à bulles doit être vidé de l'eau avant que le système est rempli de milieu.
6. INOCULATION DE LA CELLULE DES FLUX
- De une culture de nuit faire une dilution à une densité optique désirée (par exemple pour P. aeruginosa 0,001 OD 600nm et 600nm pour les 0,1 DO S. cerevisiae).
- Utiliser une seringue de 0,5 ml avec une aiguille 27G à charge d'inoculum assez pour remplir la chambre. 250 uL est suffisante pour les chambres de débit ayant les dimensions spécifiées dans ce travail (figure 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm).
- Arrêter la pompe péristaltique.
- Pince hors du tube en silicone menant à la cellule d'écoulement pour éviter le refoulement dans le système.
- Stériliser le site d'inoculation sur le tube de silicone en l'essuyant avec de l'éthanol à 70%.
- Insérez l'aiguille dans le tube de silicone et d'introduire l'embout dans l'entrée de la cellule d'écoulement. Injecter lentement l'inoculum dans la chambre (attention de ne pas injecter de bulles d'air).
- Retirez l'aiguille et essuyez le site de l'injection d'éthanol à 70%, suivi par scellement immédiat du trou avec de la colle silicone sur le site d'injection.
- Tournez sur la cellule de flux et laissez-les micro-organismes adhèrent au substrat pendant 1 heure sans écoulement à travers la cellule d'écoulement.
- Tourner la cellule d'écoulement, démarrer la pompe moyen (3 mL / h / voie) et prendre la pince hors du tube de silicone.
- Le système est placé en incubation à 37 ° C dans le cas de P. aeruginosa et 30 ° C dans le cas de S. cerevisiae.
- Biofilm dans les chambres d'écoulement peuvent maintenant être visualisés par CLSM.
7. Coloration des BIOFILM POUR MICROSCOPIE
- Faire une dilution de la coloration appropriée (par exemple 1:1000 Syto 9 vivons taches pour S. cerevisiae)
- Arrêter la pompe péristaltique.
- Pince de tube en silicone menant à la cellule d'écoulement.
- Stériliser site d'inoculation sur le tube de silicone en l'essuyant avec de l'éthanol à 70%.
- Utiliser une seringue de 0,5 ml avec une aiguille 27G pour charger solution de coloration assez pour remplir la chambre. 250 uL est suffisante pour les chambres de flux utilisée ici.
- Insérez l'aiguille dans le tube de silicone et d'introduire l'embout dans l'entrée de la cellule d'écoulement. Injecter lentement la solution de coloration dans la chambre (attention de ne pas injecter des bulles).
- Retirez l'aiguille et essuyez le site de l'injection d'éthanol à 70%, suivi par d'étanchéité immédiate du site d'injection.
- Laisser la cellule de flux sans écoulement pendant 15 minutes.
- Enlever la pince et démarrer le flux (3 ml / h / voie)
- Acquérir des données avec le CLSM
Discussion
Nous avons démontré un système de cellules d'écoulement qui représente un outil puissant dans les enquêtes de biofilm. Combiné avec l'imagerie 3D par microscopie confocale, le système a une gamme d'avantages en comparaison à d'autres méthodes d'analyse des biofilms microbiens par des moyens plus traditionnels des techniques microscopiques. Ce système permet la visualisation 3D de la vie des communautés microbiennes du biofilm sans perturbation de la communauté. La microscopie optique ne sera pas fournir des informations détaillées sur des niches du biofilm et tandis que la microscopie électronique offre une résolution nanométrique du biofilm, il ne permet pas l'imagerie de cellules vivantes.
En utilisant le système d'écoulement décrite canal, nous avons déjà élucidé la distribution spatiale des cellules bactériennes sensibles à plusieurs antibiotiques 5-8 (figure 4a), la distribution des composés extracellulaires, par exemple, l'ADN 9-11 et la distribution des cellules mobiles et non mobiles des la même espèce au sein d'une communauté bactérienne 4,6,9 (figure 4C). Nous prévoyons que le système de la cellule à flux peuvent être utilisées pour étudier les aspects de biofilms levure. Cela peut être la distribution spatio temporelle du biofilm levure en réponse à des facteurs environnementaux tels que les fongicides ainsi que l'identification de gènes impliqués dans le développement du biofilm levure. Bien que la levure n'est pas connue pour se différencier en cellules mobiles et non mobiles, d'autres aspects de la diversification de biofilm peut être des études telles que le changement morphologique des cellules de la levure à pseudohyphal et le passage de cellules diploïdes d'haploïdes.
Nous avons montré un système qui se conformer à plusieurs espèces microbiennes et travaillera avec plusieurs techniques de coloration. Une variété de sondes coloration différente et des protéines fluorescentes, comme la GFP, à permettre des enquêtes créneau spécifique dans le biofilm en développement et est un outil efficace dans l'analyse de l'effet des agents antimicrobiens ou d'autres facteurs environnementaux. Les informations qui peuvent être acquises est très détaillé (figure 4) et des fonctionnalités dans le biofilm peut être quantifié avec des programmes informatiques tels que COMSTAT 12,13.
Globalement, l'aspect le plus critique de ce protocole est le fait qu'il est un processus fastidieux. Il est aussi une limitation que les cellules doivent être capables de croître sur un non-fluorescents, surface transparente. . Depuis le biofilm formé est analysé à l'aide d'un microscope confocal, la profondeur qui peut être étudié est limité à quelques centaines de micromètres 14 Il ya encore des limitations techniques inhérentes à la conception: le système n'est pas adapté pour le criblage haut débit, comme un chercheur expérimenté peut traiter au maximum d'environ 15 canaux par expérience, ce qui peut prendre plusieurs jours pour se préparer. Toutefois, les antibiotiques ou des mutants qui sont jugées pertinentes pour des études biofilm peut être initialement projeté de masse avec d'autres méthodes telles que la coloration au cristal violet, avant les candidats les plus intéressants sont transférées vers le système cellule d'écoulement. Les feuilles de verre de couverture sont très minces et cassants, et les soins devraient être prises lors de la manipulation des systèmes. En outre, le tube doit être examinée par jour pendant l'exécution d'une expérience; aussi considérable "retour à la croissance» dans les tubes d'entrée juste en amont du flux de cellules peuvent se produire. Une telle contamination peut être résolu en supprimant plusieurs centimètres de tube en silicone du côté entrée des cellules d'écoulement, en utilisant une technique stérile.
Figure 4 a) 4 jours PAO1 anciens -. Biofilm GFP traitées pendant 24h avec la colistine et l'iodure de propidium pour la coloration de morts (tache rouge) b) présentation en 3D d'une journée de trois anciens P. aeruginosa PAO1 (type P. aeruginosa sauvage) - GFP biofilm 6 c) la présentation d'une image 3D PAO1 - PCP pilA mutant (bleu) avec une PAO1 type sauvage YFP (jaune) d) cinq jours anciens PAO1 - GFP biofilm présenté comme un 3D e photo) 26 h S. cerevisiae (ptr3 mutantes dans CEN.PK fond) biofilms colorés avec Syto-9 15.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
Tubing:
Media
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