Summary
Protocolo que descreve a aplicação de um sistema de célula de fluxo para o cultivo e análise de biofilmes microbianos para Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM).
Abstract
Células microbianas muitos têm a capacidade de formar comunidades microbianas sésseis definido como biofilmes que alteraram as propriedades fisiológicas e patológicas em comparação com microorganismos de vida livre. Biofilmes na natureza são muitas vezes difíceis de investigar e residir sob condições definidas mal 1. Usando um substrato transparente é possível a um dispositivo de sistema onde biofilmes simples podem ser analisados de forma não-destrutiva em tempo real: aqui demonstrar a montagem e operação de um sistema modelo de fluxo de células, para estudos in vitro de biofilmes microbianos em 3D gerando alta reprodutibilidade sob condições bem definidas 2,3.
O sistema consiste de uma célula de fluxo, que serve como câmara de crescimento para o biofilme. A célula de fluxo é fornecido com nutrientes e oxigênio a partir de um frasco médio através de uma bomba peristáltica e médio gasto é coletada em um recipiente de resíduos. Esta construção do sistema de fluxo permite um fornecimento contínuo de nutrientes e administração de antibióticos por exemplo, com o mínimo de perturbação das células cultivadas em câmara de fluxo. Além disso, as condições de fluxo dentro da célula de fluxo permitem estudos de biofilme expostos a tensão de cisalhamento. Uma bolha bolhas de interceptação dispositivo limites de ar da tubulação que de outra forma poderiam perturbar a estrutura do biofilme na célula de fluxo.
O sistema de célula de fluxo é compatível com Microscopia Confocal Laser Scanning (CLSM) e pode, assim, fornecer informações altamente detalhadas em 3D sobre o desenvolvimento de biofilmes microbianos. Células no biofilme podem ser rotulados com sondas fluorescentes ou proteínas compatível com a análise CLSM. Este permite a visualização on-line e permite investigação de nichos no desenvolvimento de biofilme. Inter-microbiana, a investigação de agentes antimicrobianos ou a expressão de genes específicos, são muitas das configurações experimentais que podem ser investigadas no sistema de célula de fluxo.
Protocol
1. Montagem do sistema de células de fluxo com todos os componentes
O sistema de fluxo montado inclui: tubos de autoclave, armadilhas bolha, médio / frasco de resíduos e células de fluxo, como mostrado na Figura 1. Todas estas peças podem ser reutilizados entre experimentos.
Figura 1. O fluxo de configuração do sistema de células (componentes essenciais da configuração). O sistema de célula de fluxo é composto por vários componentes: uma garrafa média, uma bomba peristáltica, armadilhas bolha, a célula de fluxo, uma garrafa de resíduos, e diversas seções de tubos interligados por vários conectores. Figura gentilmente cedidas por Rune Lyngklip.
2. Assembleia da Célula de Fluxo
- A célula de fluxo (Figura 2a) é tratada com faixas finas de cola de silicone, usando uma seringa (Figura 3).
- Coloque uma lamínula em cima das linhas de silicone (Figura 3). Lamínulas de vidro são utilizados como substrato para P. aeruginosa, enquanto lamínulas PVC são aplicados para S. biofilme cerevisiae.
Figura 2. Desenho esquemático da célula de fluxo eo borbulhador 2. Descrição detalhada das dimensões utilizadas para a produção de a) borbulhador fluxo de células b), DTU Biologia de Sistemas. Reproduzido com permissão de John Wiley &, Sons Inc. (DTU Biologia de Sistemas estava anteriormente autorizado Biocentrum, conforme ilustrado na figura)
Figura 3. Ilustração do silicone linhas aplicação de cola para a montagem do substrato de vidro. O vidro da tampa indicada é colocada sobre a cola de silicone para anexá-lo à célula de fluxo.
- Vire a célula de fluxo e coloque-o sobre uma superfície plana com o lado da lamínula para baixo. Pressione suavemente a parte de trás da célula de fluxo para empurrar a lamínula sobre a base da célula de fluxo. Vire a célula de fluxo mais e inspecionar áreas que não são selados pelo silicone. A alça parte (pistão) de uma seringa pode ser usado como uma ferramenta para pressionar cuidadosamente o celular de vidro e fluxo juntos.
3. Garrafa médio
- Coloque um tubo de silicone de alimentação (2 mm de diâmetro interno) em um frasco médio e inserir um conector reto na outra extremidade.
- Adicionar médio para a garrafa (para conteúdo médio ver "media" parágrafo)
Tampa do conector e uma garrafa com folha de metal e autoclave o meio. Certifique-se que a extremidade do tubo de alimentação é fixado acima do nível do líquido no frasco médio ou um efeito de sifão pode esvaziar a garrafa médio quando autoclave.
4. Conectando a Bolha Armadilha célula de fluxo, e Bomba
Montar toda a tubulação de acordo com o esboço na Figura 1. Use tubos de silicone com excepção da parte que atravessa a bomba peristáltica, onde tubos Marprene é aplicada.
- , A fim de ligar o tubo do frasco de médio a todas as câmaras de fluxo individual, dividir um tubo para o número necessário de entradas aplicada no experimento. Use T-conectores para tornar o número desejável de tubos de conexão do tubo de alimentação para os tubos de Marprene na bomba (ver Figura 1, T-conector). É geralmente uma boa idéia para manter a ordem mesma seqüência de tubos e células de fluxo em todo o sistema, para facilitar a identificação dos componentes em caso de falhas no sistema.
- Conectar cada tubo de alimentação individual (2 mm de diâmetro) para Marprene tubos na bomba usando conectores retos. Conecte o tubo Marprene a um borbulhador (Figura 2b), através de tubo de silicone intermediários (1 mm de diâmetro). Certifique-se que a bomba está ligado à entrada na parte mais alta do borbulhador.
- Conecte o tubo de saída resultantes das armadilhas bolha para a entrada de célula de fluxo (1 mm de diâmetro), certifique-se que o comprimento desses tubos permite que a célula de fluxo para ser transferido para o estágio do microscópio confocal (geralmente 1 m).
- Colocar 5 mL de seringas em cima das armadilhas da bolha. Fechar os topos com tampas adequadas.
- Na saída da célula de fluxo conectar um curta, um pedaço de aproximadamente 40 milímetros de (1 mm de diâmetro), tubos e usar uma "redução" conector em linha reta para prender um tubo de resíduos (2 mm de diâmetro) de comprimento necessário. Coloque os tubos de resíduos no contentor de resíduos.
- Importante, o recipiente de resíduos deve ser sempre colocado no mesmo nível que as células de fluxo, nunca abaixo de célula de fluxo nível. Além disso, certifique-se que o fim do tubo de resíduos é fixado acima do nível esperado de resíduos líquidos para evitar flush-costas devido a um efeito de sifão ao manusear as células de fluxo.
5. Esterilização e lavagem do SISTEMA DE FLUXO
- Retire as tampas borbulhador e colocá-los em etanol 70% para mantê-las estéreis.
- Executar na velocidade mais alta da bomba para encher o sistema com 0,5% (v / v) de hipoclorito de sódio na água. </ Li>
- Coloque as tampas borbulhador para trás, quando as armadilhas bolha estão completamente preenchidos.
- Toque as células de fluxo para remover as bolhas na câmara de fluxo. Tome cuidado para não danificar a tampa de vidro frágil.
- Permitir que o sistema para esterilizar para h 04/03 a uma vazão de 3 mL / h / canal (0,2 mm / s taxa de fluxo linear).
- Lavar o sistema 2-3 vezes para lavar todas as hipoclorito. Encher e esvaziar o sistema com água estéril. Armadilhas bolha deve ser esvaziado completamente entre cada lavagem. Isto pode ser feito através de bombeamento no ar, até armadilhas bolha foram esvaziados. Depois de esvaziar, remova as tampas das armadilhas bolha antes de reencher o sistema. Recoloque as tampas após a bolha armadilhas foram completamente cheio de líquido. Repita conforme necessário.
- Run água estéril através do sistema a um fluxo baixo (1-3 mL / h / canal) durante a noite ou prosseguir para a próxima etapa.
- Conecte a garrafa de meio para a entrada e lave o sistema com o meio durante a noite com baixa taxa de fluxo (3 mL / h / canal) à temperatura onde o experimento será executado. Nota: armadilhas bolha deve ser esvaziada por água antes que o sistema é preenchido com o meio.
6. Inoculação de célula de fluxo
- De uma cultura de noite fazer uma diluição para uma densidade óptica desejada (por P. aeruginosa por exemplo, 0,001 OD 600nm e 0,1 OD 600nm de S. cerevisiae).
- Use uma seringa de 0,5 ml com uma agulha de 27G para carregar inóculo suficiente para encher a câmara. 250 L é suficiente para as câmaras de fluxo com as dimensões especificadas neste trabalho (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm).
- Pare a bomba peristáltica.
- Grampo fora do tubo de silicone conduz à célula de fluxo para evitar o refluxo no sistema.
- Esterilizar o local da inoculação sobre o tubo de silicone, limpando-a com álcool 70%.
- Inserir a agulha no tubo de silicone e introduzir a ponta na entrada da célula de fluxo. Injecte lentamente o inóculo para a câmara (ter cuidado para não injetar bolhas de ar).
- Remova a agulha e limpe o local da injecção com etanol 70% seguido de imediata selagem do furo usando cola de silicone sobre o local da injeção.
- Vire a célula de fluxo e deixe os micro-organismos aderem ao substrato por 1 hora sem fluxo através da célula de fluxo.
- Vire a célula de fluxo, ligar a bomba de médio (3 mL / h / canal) e tirar a braçadeira fora do tubo de silicone.
- O sistema é colocado para incubação, a 37 ° C no caso de P. aeruginosa e 30 ° C no caso de S. cerevisiae.
- Biofilme nas câmaras de fluxo pode agora ser visualizado por CLSM.
7. COLORAÇÃO de biofilme para Microscopia
- Fazer uma diluição da coloração adequada (por exemplo 1:1000 Syto 9 ao vivo mancha de S. cerevisiae)
- Pare a bomba peristáltica.
- Braçadeira do tubo de silicone conduz à célula de fluxo.
- Esterilizar local de inoculação sobre o tubo de silicone, limpando-a com álcool 70%.
- Use uma seringa de 0,5 ml com uma agulha de 27G para carregar solução corante suficiente para encher a câmara. 250 L é suficiente para as câmaras de fluxo usados aqui.
- Inserir a agulha no tubo de silicone e introduzir a ponta na entrada da célula de fluxo. Injecte lentamente a solução de coloração para a câmara (ter cuidado para não injetar bolhas).
- Remova a agulha e limpe o local da injecção com etanol 70% seguido de imediata selagem do local de injecção.
- Deixe a célula de fluxo sem fluxo por 15 minutos.
- Tirar a braçadeira e iniciar o fluxo (3 mL / h / canal)
- Aquisição de dados com o CLSM
Discussion
Temos demonstrado um sistema de célula de fluxo que representa uma poderosa ferramenta nas investigações biofilme. Combinado com imagens em 3D através de microscopia confocal, o sistema tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos de análise de biofilmes microbianos por meio dos mais tradicionais técnicas de microscopia. Este sistema permite a visualização 3D de vida das comunidades biofilme microbiano sem perturbação da comunidade. Microscopia de luz não fornecerá informações detalhadas sobre os nichos do biofilme e enquanto a microscopia eletrônica fornece uma resolução em nanoescala do biofilme, ele não permite que imagens de células vivas.
Usando o sistema de canais de fluxo descrito anteriormente elucidado temos a distribuição espacial das células bacterianas sensíveis a vários antibióticos 5-8 (Figura 4), a distribuição de compostos extracelulares, por exemplo, DNA e 11/09, a distribuição de células móveis e não móveis de mesma espécie dentro de uma comunidade bacteriana 4,6,9 (Figura 4c). Nós prevemos que o sistema de célula de fluxo pode ser usado para estudar os aspectos de biofilmes levedura. Esta pode ser a distribuição espaço temporal de biofilme levedura em resposta a fatores ambientais, tais como fungicidas, bem como a identificação de genes envolvidos na formação do biofilme por leveduras. Apesar de levedura não se sabe se diferenciar em células móveis e não móveis, outros aspectos de diversificação biofilme podem ser estudos, tais como a mudança morfológica de levedura para as células e pseudohyphal a mudança de haplóides de células diplóides.
Nós mostramos um sistema que respeitar uma série de espécies microbianas e vai trabalhar com várias técnicas de coloração. Uma variedade de sondas de coloração diferente e proteínas fluorescentes, como o GFP, a possibilitar a investigação nicho específico no biofilme em desenvolvimento e é uma ferramenta eficiente para analisar o efeito de agentes antimicrobianos ou outros fatores ambientais. A informação que pode ser adquirida é muito detalhado (Figura 4) e recursos do biofilme pode ser quantificado com programas de computador, tais como COMSTAT 12,13.
No geral, o aspecto mais crítico do protocolo é o fato de que é um processo demorado. É também uma limitação de que as células precisam ser capazes de crescer em uma superfície não fluorescente, transparente. . Desde a formação de biofilmes é analisada utilizando um microscópio confocal, a profundidade que pode ser investigado é limitada a algumas centenas de micrômetros de 14 Há ainda limitações técnicas inerentes ao projeto: o sistema não é adequado para triagem de alto rendimento, como um investigador experiente pode lidar com no máximo cerca de 15 canais por experiência, que por sua vez pode levar vários dias para se preparar. No entanto, antibióticos ou mutantes que são consideradas relevantes para estudos de biofilmes pode ser inicialmente massa rastreados com outros métodos, como a coloração violeta cristal antes de os candidatos mais interessantes são transferidos para o sistema de célula de fluxo. As folhas de cobertura de vidro são muito finos e se quebram facilmente, e cuidados devem ser tomados no manuseio dos sistemas. Além disso, os tubos devem ser examinados diariamente durante a execução de um experimento, como considerável "de volta o crescimento" nos tubos de entrada logo acima das células de fluxo pode ocorrer. Esta contaminação pode ser resolvido através da remoção de vários centímetros de tubo de silicone do lado de entrada das células de fluxo, usando técnica estéril.
Figura 4 a PAO1) quatro dias de idade -. GFP biofilme tratadas por 24h com Colistina e iodeto de propídio para a coloração de mortos (mancha vermelha) b) apresentação em 3D de um de três dias de idade P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa tipo selvagem) - GFP biofilme 6 c) apresentação 3D imagem de um PAO1 - PCP pila mutante (azul) com um tipo selvagem PAO1 YFP (amarelo) d) 5 dias PAO1 idade - GFP biofilme apresenta-se como um 3D e imagem) 26 h S. biofilme cerevisiae (PTR3 mutante em CEN.PK fundo) corados com Syto-9 15.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
Tubing:
Media
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