Summary
Ici, nous décrivons une méthode pour la cryoconservation efficace et dégel du cortex cérébral des blocs de tissus pour générer hautement enrichi cultures neuronales. Ce protocole simple fournit la flexibilité pour la génération plus tard, des neurones, des astrocytes et des cultures de cellules neuronales précurseur.
Abstract
Dans cette étude, nous présentons un protocole standardisé pour la cryoconservation et la décongélation de succès corticale blocs de tissus du cerveau pour générer hautement enrichi cultures neuronales. Pour ce protocole le milieu de congélation utilisé est de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dilué dans une solution saline tamponnée de Hank (HBSS). Les blocs de tissu cortical sont transférés à cryotubes contenant le milieu de congélation et lentement congelés à -1 ° C / min dans un récipient vitesse contrôlée de congélation. Post-traitement de dégel et de la dissociation des blocs de tissus congelés systématiquement produit des cultures enrichies en neurones, qui a affiché une croissance neuritique rapide au cours des 5 premiers jours de culture et de l'expansion importante du réseau neuronal dans les 10 jours. Coloration immunocytochimique avec le marqueur protéique astrocytaire acide fibrillaire gliale (GFAP) et le marqueur de neurones bêta-tubuline de classe III, a révélé un nombre élevé de neurones et les astrocytes dans les cultures. Génération de neurones cultures de cellules précurseurs de tissus après la dissociation conduit à bloquer en pleine expansion neurosphères, qui a produit un grand nombre de neurones et les astrocytes dans des conditions de différenciation. Ce protocole de cryoconservation simple permet de rapides, de conservation efficace et peu coûteux de corticale blocs de tissus du cerveau, qui accorde une flexibilité accrue pour la production ultérieure de neurones, astrocytes, neurones et les cultures de cellules précurseurs.
Protocol
1. La cryoconservation de tissu cortical Blocks
Préparation des matériaux
- Préparer la solution 1X Hank saline tamponnée (HBSS) en diluant la solution mère à 10X dans de l'eau stérile (1:9). HBSS magasin à 4oC.
- Préparer 10% milieu de congélation du DMSO en diluant DMSO dans HBSS (1:9). Le milieu de congélation doivent être préparées avant la cryoconservation et conservés à 4 ° C jusqu'à refroidissement.
- Une lame de rasoir en acier est utilisé pour le hacher systématique des tissus. Avant l'utilisation, la lame de rasoir est stérilisé par immersion dans l'éthanol à 70% pendant 2 heures. Immédiatement avant le traitement des tissus, rincer la lame de rasoir à l'eau stérile 3 fois. Évitez de laisser le rasoir dans l'eau stérile pour une quantité excessive de temps, car il est sensible à l'oxydation.
- Un conteneur de congélation Nalgene est chargé avec cryotubes (2,5 ml) et ensuite amené dans une armoire biologique stérile. 1 ml de milieu de congélation glacée est ajoutée à chaque flacon. Le conteneur de congélation est alors placé à 4 ° C pendant au moins 2 heures.
Nettoyage, découper, et le gel
- Le tissu cérébral à congeler est nettoyée de la membrane méningée et les vaisseaux sanguins. Utilisez conseils aiguille stérile pour enlever soigneusement les débris du tissu tout en travaillant sur le dessus d'un sac de glace. Tissus nettoyables doivent être rincés doucement avec HBSS froid et transféré à un nouveau plat de Pétri pour hacher.
- Travail sur le dessus d'un sac de glace, utilisez une lame de rasoir stérilisée pour rapidement couper le tissu dans environ 1 mm 3 blocs. Travailler avec de petites portions de tissus nettoyés au temps entraîne un meilleur contrôle sur la procédure de hachage, résultant en des tailles de bloc plus homogène.
- Ajouter lentement les tissus hachés dans 50 ml de HBSS dans un tube conique de 50 ml. Rincer délicatement la boîte de Pétri avec HBSS afin de collecter tous les blocs de tissus restants. Autoriser les blocs de tissus pour descendre au fond du tube, créant un bloc de tissu légèrement tassées à granulés.
- Alors que le tissu est de décantation, mettre le récipient préalablement refroidi congélation et cryotubes dans l'armoire de sécurité biologique. Débouchez toutes les cryotubes de hâter le processus d'ajout de tissu.
- Après tous les blocs de tissus se sont installés, doucement aspirer le HBSS excès, laissant une très fine couche de média-dessus du culot. La centrifugation est déconseillée car elle va provoquer des blocs de tissus d'adhérer les unes aux autres, diminuant de manière significative l'efficacité de congélation.
- Lentement recueillir 200 uL du fond de la dérive des tissus bloc granulés en utilisant la pointe de pipette avec des orifices larges (coupe la pointe avec des ciseaux stériles). Transfert du matériel à un cryovial et de passer à la suivante, des tissus à nouveau la collecte à partir du bas de la pastille. Il est essentiel que la procédure d'attribution des tissus ensemble ne prend pas plus de 3-4 min par conteneur de congélation. Cela garantit que le tissu est exposé à du DMSO pour seulement une courte période de temps avant la congélation. Après le transfert du tissu pour les flacons, placez le récipient dans un gel-80oC congélateur pendant au moins 4 heures. Alternativement, le récipient de congélation peut être laissé une nuit à -80 oC. Répétez ce processus pour tous les conteneurs de congélation restantes.
- Transférer les cryotubes dans le conteneur de congélation (s) à un cryobox et placer dans un réservoir d'azote liquide pour stockage à long terme.
2. La décongélation et la culture de Frozen Blocks tissu cortical
Préparation des matériaux
- Un jour avant le dégel des échantillons de tissus, de poly-L-lysine revêtement boîtes de Petri / lamelles sont préparés. En général, pour les neurones corticaux nous préparons des plats revêtus avec 500 ug / ml ou 1 mg / ml. Ajouter suffisamment d'acide poly-L-lysine solution (faites dans un tampon de borate) pour couvrir entièrement le fond du plat. Si lamelles de verre sont nécessaires, s'assurer qu'ils sont complètement submergés sous la solution de poly-L-lysine. Incuber pendant au moins 12 hr. Avant l'utilisation, rincer la vaisselle avec une généreuse quantité d'eau stérile 3 fois, 5 minutes chacun.
- HBSS chaud est utilisé pour nettoyer les tissus décongelés ainsi que de dissocier le tissu dans des suspensions cellulaires. Le volume de HBSS nécessaire variera en fonction de la quantité de tissu à être décongelés, mais typiquement une cryovial va diluer dans 50 ml de HBSS et seront dissociées dans 10 ml de HBSS.
- Eagle modifié par Dulbecco moyenne avec 10% des suppléments de fer du sérum de veau bovin (EBS) et 1% d'antibiotique / antimycotique (AA) mélange (DMEM (++)) devrait être placé dans un bain à 37 ° C l'eau.
- Milieu d'étalement (NB (+++)) doivent être préparées avant l'utilisation. Ce milieu est préparé en ajoutant 1% d'antibiotique / antimycotique ainsi B27 et les compléments de N2.
Remarque: Les noms des médias en annexe avec des croix (+) indique l'inclusion d'additifs à la composition de base des médias. Dans ce texte, DMEM (+ +) indique DMEM plus 10% EBS majoré de 1% AA, tandis NB indique (+++) NB plnous 1% AA et B27 ainsi que N2.
La décongélation et la culture
- Retirez les cryotubes du réservoir d'azote liquide et de dégel rapide à 37 ° C dans un bain d'eau glacée jusqu'à ce que seul une petite pastille est observée à l'intérieur du contenu du flacon.
- Délicatement le transfert le contenu du flacon de 50 ml de HBSS au chaud dans un tube conique. Utiliser un embout large orifice pour doucement déloger les blocs de tissus restent coincés dans le cryovial. Inverser le tube 3-4 fois et laissez le tissu à recueillir lentement vers le bas. Les tissus doivent régler rapidement, mais si les blocs sont trop petits cela peut ne pas se produire et la lumière de centrifugation (~ 200 x g) est recommandée.
- Aspirer HBSS excès.
- Ajouter 10 ml de HBSS chaude pour le tissu et de culot 300 pi de trypsine à 0,25% et de 50 uL d'ADNase. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 5 min, puis placer dans un agitateur orbital à 80 rpm jeu et 37 ° C pendant 5 minutes supplémentaires.
- Après cette période, amener les blocs de tissus dans une enceinte de sécurité biologique et l'utilisation d'une pipette 10 ml de bien agiter le blocs de tissus jusqu'à une suspension de cellules trouble est formé. Désactiver la trypsine en ajoutant 10 ml de DMEM chaude (+ +) à la suspension cellulaire.
- Centrifuger les cellules dissociées à 1200 x g pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml d'eau tiède DMEM (+ +) et de quantifier le nombre de cellules en utilisant un hématimètre.
- Cellules de la plaque de poly-L-lysine plats revêtus. Typiquement, un plat de 60 mm sera plaqué avec 1x10 6 cellules.
- Laisser les cellules d'attacher au plat / lamelles d'environ 1 h dans l'incubateur de culture tissulaire. Il est recommandé de suivre les progrès de l'attachement dans une plaque toutes les 10 min jusqu'à ce l'attachement effectif est observé. Puis, doucement remplacer le milieu avec du DMEM frais (++).
- Après 24 h, remplacer le DMEM (+ +) avec les chaudes NB (+++). Changements de milieu partielle (50%) sont effectuées tous les 5 jours avec frais NB (+++). Cultures saines montrent habituellement des signes de différenciation et de croissance des processus après 24 heures. Dans ces conditions, et effectuer des changements partiels moyenne tous les 4-5 jours, les cultures peuvent être maintenues pendant des périodes prolongées jusqu'à 4-6 semaines.
- Pour la génération des cellules précurseurs neuronales (CPN), un protocole similaire est utilisé à l'exception que, après centrifugation, DMEM sans EBS est utilisé. Les cellules sont étalées dans le T-25 flacons de DMEM/F12 (1:3) complété avec B27 et l'EGF (20 ng / ml) pour permettre la formation d'neuropheres. Pour différencier les PNJ, neurosphères sont étalées sur la laminine (10 ug / ml) recouvert de lamelles de DMEM/F12 (1:3) milieu supplémenté avec N2.
3. Les résultats représentatifs
Cultures saines montrera une croissance importante et de différenciation après 5 jours post-décongélation et seront généralement stabiliser dans sa croissance en 10 jours (figure 1). Coloration Immuncocytochemical de ces cultures révèle de nombreux astrocytes (figure 2A) et les neurones (figure 2B) pour les humains et les rats des cultures primaires de neurones. Ce protocole est également approprié pour la génération de PNJ que flottant neurosphères (figure 3A), qui dans des conditions de différenciation, le résultat dans les cultures mixtes de haute qualité (figure 3B, C).
Figure 1. Des cultures cellulaires de tissu cortical humain congelé. Frozen humaine blocs de tissus corticaux sont décongelées et plaquées sur la poly-lysine lamelles couché et cultivées pendant 10 jours. Dès le jour 5 expansion cellulaire est apparente et par jour 10 confluence est atteinte. Barre d'échelle: 100 um.
Figure 2. Coloration immunocytochimique de cultures cellulaires. (A) Les cultures ont été colorés avec le marqueur protéine gliale acide fibrillaire gliale (GFAP, flèches épaisses). (B) Les neurones ont été détectés avec le marqueur neuronal bêta-tubuline III (TIII, flèches fines). (C) Les deux rats et des cultures humaines montrent gliales et neurones abondante après 10 jours de culture. Anticorps primaire: la souris anti-GFAP (1:1000) et de lapin anti-TIII (1:1000). Anticorps secondaire: anti-souris Alexa 594 (1:500) et anti-lapin Alexa 488 (1:500). Coloration des noyaux: Hoestch bleue (1:1000). Barre d'échelle: 50 um.
Figure 3. Génération de neurosphères. (A) des tissus congelés a été traitée comme décrit ci-dessus et a permis de se propager comme neurosphères. (B) neurosphères ont été étalées sur des lamelles de verre dans des conditions de différenciation et cultivées pendant 10 jours, ce qui entraîne la migration des cellules loin de la Neurosphère. (C) Les deux neurones et les astrocytes sont présents dans la frange d'une expansion Neurosphère différencier. Contre-coloration nucléaire, les anticorps primaires et secondaires utilisés comme dans la figure 2.
Discussion
Cryoconservation offre une opportunité précieuse à la banque d'échantillons de tissus du cerveau pour une utilisation future. Nous décrivons ici un protocole simple mais efficace pour générer deux neurones enrichi les cultures et les cellules précurseurs des neurones à partir des blocs congelés tissu cérébral. Cette procédure évite les coûts économiques des techniques de cryoconservation traditionnelles qui utilisent plus cher vitesse contrôlée congélateurs. Le protocole permet la génération de cultures de neurones viables après décongélation en fournissant un moyen rapide et efficace pour geler les blocs de tissus. Le processus de congélation entier peut prendre aussi peu que 20 minutes. En plus de cultures neuronales primaires, en utilisant cette méthode de blocs de tissus peuvent également être décongelés à générer des PNJ grandi comme libre neurosphères flottant. À cet égard, le manque de sérum dans notre milieu de congélation assure que les cellules sont conservés dans un état indifférencié. Dans des conditions de différenciation, neurosphères produite à partir de l'expansion des tissus congelés et montrent des taux de différenciation très comparable à neurosphères générés à partir de tissus frais.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions de la recherche Possibilités programme de premier cycle à l'UCI (AR et SP) et des subventions de l'Etat de Californie, l'initiative la maladie d'Alzheimer et les National Institutes of Health accorde pas. HD38466, et le Centre de recherche sur les maladies d'Alzheimer accorde pas. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
