Summary
ここで、我々は、効率的な凍結保存方法を説明し、高濃縮ニューロン培養を生成するために皮質脳組織ブロックの解凍。この単純なプロトコルでは、神経細胞のアストロサイト、および神経前駆細胞培養の後の世代のための柔軟性を提供します。
Abstract
本研究では、我々は、高濃縮ニューロン培養を生成するために皮質脳組織ブロックの成功凍結保存と解凍のための標準化されたプロトコルの概要を説明します。このプロトコルで使用される凍結培地は、ハンクのバッファ塩溶液（HBSS）で希釈した10％のジメチルスルホキシド（DMSO）である。皮質組織のブロックは、凍結培地を含むcryovialsに転送され、徐々に速度制御された冷凍コンテナの° C / min -1ので凍結されています。解凍後の処理と一貫して10日以内に文化と神経回路網の大幅な拡大の最初の5日間に急速な神経突起の成長を示した神経細胞に富む文化を生成した凍結組織ブロックの解離。アストロサイトマーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）および神経マーカーβ-チューブリンクラスIIIと免疫細胞化学的染色は、文化のニューロンとアストロサイトの高い数字を明らかにした。組織ブロックの解離後の神経前駆細胞培養の世代は急速に分化する条件下でニューロンとアストロサイトの大きな数字を生成したニューロスフェアを、拡大をもたらした。この単純な凍結保存プロトコルは、神経細胞アストロサイト、および神経前駆細胞培養の後の世代のための高い柔軟性を与える皮質脳組織ブロックの迅速、効率的、かつ安価な保存、することができます。
Protocol
1。皮質組織ブロックの凍結保存
材料の準備
- 滅菌水で10倍ストック溶液（1:9）で希釈することにより1Xハンクスバッファード塩類溶液（HBSS）を準備する。 4℃でHBSSを保管してください。
- HBSS（1:9）でDMSOを希釈して10％DMSOを凍結培地を準備します。凍結培地は、凍結保存前の新鮮なものとチルドまで4℃で保存してください。
- 鋼のカミソリの刃は、組織の体系的チョッピングのために使用されます。使用前に、カミソリの刃は2時間、70％エタノールに浸して殺菌される。すぐに組織の処理の前に、滅菌水で3回カミソリの刃を洗う。それが酸化されやすいため、時間の過度の量の滅菌水にカミソリを放置しない。
- Nalgeneの冷凍コンテナはcryovials（2.5mL）でロードされ、無菌生物学的なキャビネットに入れられます。チルド凍結培地1mlを各バイアルに追加されます。冷凍コンテナは、少なくとも2時間4℃で配置されます。
、クリーニングチョッピング、および凍結
- フリーズする脳組織は、髄膜と血管の洗浄される。アイスパックの上で作業しながら慎重に組織からごみを削除するには、滅菌針のヒントを参考にしてください。洗浄組織は冷HBSSで軽くすすぎ、チョッピングのための新しいシャーレに転送する必要があります。
- アイスパックの上部に取り組んで、急速に約1mm 3ブロックに組織を分割する場合に滅菌カミソリの刃を使用してください。より均一なブロックサイズで、その結果、チョッピングの手順を適切に制御における時間の結果で洗浄組織の小さな部分での作業。
- 徐々に50 mLコニカルチューブにHBSS 50mlに切り刻まれた組織を追加します。ゆっくりと、残りの組織ブロックを収集するために、HBSSでペトリ皿を洗う。緩くパックされた組織ブロックペレットを作成し、組織ブロックをチューブの底に下降することができます。
- 組織がセトリングしている間、生物学的安全キャビネット内に以前にチルド冷凍コンテナとcryovialsをもたらす。組織を追加するプロセスを早めるために、すべてのcryovialsを暴露する。
- すべての組織ブロックが定着した後、軽くペレット上記のメディアの非常に薄い層を残して、余分なHBSSを吸引除去する。それが組織ブロックは互いに、大幅に減少冷凍効率に付着する原因となります遠心分離することは推奨されません。
- ゆっくりと広い開口部（滅菌済みのハサミで先端をカット）とピペットチップを使用して緩い組織ブロックペレットの底から200μLを収集する。 oneクライオバイアルに材料を移し、ペレットの底から次の、もう一度収集組織に移ります。それは全体の組織の割り当ての手順は、冷凍コンテナ3〜4分以上をとらないことが重要です。これは組織が凍結する前に時間の短期間だけDMSOにさらされることが保証されます。バイアルに組織を転送した後、少なくとも4時間、80℃冷凍庫で冷凍コンテナを配置します。また、凍結容器を-80℃で一晩放置することができます。残りの冷凍コンテナ用にこのプロセスを繰り返します。
- 冷凍コンテナ（複数可）から長期保存用液体窒素タンクでcryoboxと場所にcryovialsを転送します。
2。融解と凍結皮質組織ブロックの培養
材料の準備
- 前に解凍組織サンプルへの一日は、ポリ- L -リジンコートしたペトリ皿/カバースリップを用意しています。一般的には、皮質ニューロンのために我々は500μg/ mLのまたは1mgの/ mLでコーティングされた料理を準備。完全に皿の底をカバーするのに十分なポリ- L -リジン溶液を（ホウ酸緩衝液で作られた）を追加します。ガラス製カバースリップが必要な場合、それらは完全にポリ- L -リジン溶液で浸漬されていることを確認してください。少なくとも12時間インキュベートする。ご使用の前に、徹底的に滅菌水で3回、5分ごとのリベラルな量の料理をすすぐ。
- 暖かいHBSSは、細胞懸濁液に組織を解離するだけでなく、解凍した組織をきれいにするために使用されます。必要なHBSSの量は、融解する組織の量によって異なりますが、通常は1クライオバイアルは、HBSSを50mLに希釈し、HBSSを10mLの解離になります。
- 10％の鉄添加仔ウシ血清（EBS）と1％のダルベッコ変法イーグル培地抗生物質/抗真菌剤（AA）混合物（DMEM (++))は37℃の水浴中に配置する必要があります。
- メッキの培地（NB (+++))は使用前に新鮮なされるべきである。この培地は、抗生物質/抗真菌剤に加えてB27とN2のサプリメントを1％添加することによって調製される。
注：十字（+）を付加したメディア名がメディアの塩基組成に添加剤を含めることを示す。このテキストでは、DMEM（+ +）を意味するDMEM + 10％EBSプラス1％AA、一方、NB (+++)で囲まNB PL私たち一パーセントAAプラスB27プラスN2。
解凍と培養
- 液体窒素タンクからcryovialsを削除し、急速に37℃で融解°のみ小さなアイスペレットになるまでの水浴中でCがバイアルの内容の内部に観察される。
- 静かにコニカルチューブに暖かいHBSS 50mlのバイアルの内容を転送する。優しくクライオバイアルにはまり、残りの組織ブロックを取り除くために、広い開口部の先端を使用してください。チューブを3-4回転倒し、組織が徐々に下部に収集することができます。組織は、迅速に解決するはずですが、ブロックが小さすぎる場合、これは推奨されている遠心分離（〜200 × g）を発生し、点灯しないことがあります。
- 過剰なHBSSを吸引除去する。
- 組織ペレットと、0.25％トリプシンとDNAase 50μL、300μLに暖かいHBSSを10mLを追加。 5分間37℃の水浴中でインキュベートし、その後、軌道シェーカーの場所は、° C、さらに5分間に80回転と37に設定。
- この期間の後、生物学的安全キャビネット内に組織ブロックを持参し、曇った細胞懸濁液が形成されるまで慎重に組織ブロックを撹拌するために10 mLのピペットを使用してください。暖かいDMEM 10mLを加えることによってトリプシンを非活性化（+ +）細胞懸濁液に。
- 5分間1200 × gで解離細胞を遠心分離します。上清を吸引し、廃棄、暖かいDMEM 10mLに細胞ペレットを再懸濁します（+ +）と血球計数器を用いて細胞数を定量化する。
- ポリ- L -リジンコートディッシュ上に細胞をプレート。通常は、60 mmディッシュは、1 × 10 6個の細胞でメッキされます。
- 細胞は組織培養インキュベーターで約1時間のための料理/カバーガラスに付着することができます。それは、効果的な添付ファイルが観察されるまでワンプレートで10分ごとに添付ファイルの進捗を監視することをお勧めします。その後、ゆっくりと新鮮なDMEM (++).で培地を交換してください
- 24時間後、DMEMを交換してください（+ +）暖かいNB (+++).と部分的な媒質の変化（50％）は新鮮なNB (+++).で5日ごとに行われている健全な文化は、通常、24時間後に分化し、プロセスの成長の兆しを示しています。これらの条件下で、そしてすべての4-5日の部分培地の変更を行う、培養物まで4-6週間の時間の長時間維持することができます。
- 神経前駆細胞（NPCに）の生成では、同様のプロトコルは遠心分離後、EBSのないDMEMが使用されていることを除いて使用されます。細胞はneuropheresの形成を可能にするためにB27とEGF（20 ng / mL）を補充したDMEM/F12（1:3）でT - 25フラスコに播種されています。 NPCを区別するには、ニューロスフェアは、ラミニン（10 ug / mlと）DMEM/F12（1:3）N2を添加した培地でコーティングされたカバースリップ上に播種されています。
3。代表的な結果
健全な文化は、5日後に解凍した後、大幅な成長と分化を表示され、通常10日間（図1）によって、その成長に安定します。これらの培養物のImmuncocytochemical染色では多数の星状膠細胞（図2A）を明らかにし、ヒトおよびラットの両方の主ニューロン培養のための神経細胞（図2B）。このプロトコルは、また高品質の混合培養（図3B、C）の結果がどの差別化条件の下で自由に浮遊ロスフェア（図3A）、などのNPCの発電に適しています。
図1。凍結ヒト皮質組織の細胞培養。凍結ヒト皮質組織ブロックを解凍し、播種ポリリジンコートしたカバースリップ上で10日間栽培されている。日までに5セルの拡張は明らかであり、一日で10コンフルエントが達成されます。スケールバー：100μmである。
図2。培養細胞の免疫細胞化学染色。（）培養物は、グリアマーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP、太い矢印）で染色した。 （B）神経細胞は神経マーカーβ-チューブリンIII（TIII、細い矢印）で検出した。 （C）ともに、ヒトおよびラットの文化は文化の中で10日後の豊かなグリア細胞と神経細胞を示す。一次抗体：マウス抗GFAP（1:1000）とウサギ抗- TIII（1:1000）。二次抗体：抗マウスアレクサ594（1:500）と抗ウサギアレクサ488（1:500）。核染色：Hoestchブルー（1:1000）。スケールバー：50μmである。
図3。ニューロスフェアの世代。（）凍結組織は、上記のように処理し、ニューロスフェアとして伝播させた。 （B）ニューロスフェアは、離れてニューロスフェアから移行する細胞で、その結果、差別化の条件下でガラス製カバースリップ上にプレーティングし、10日間増殖させた。 （C）ニューロンとアストロサイトはどちらも差別化ニューロスフィアの拡大フリンジに存在している。核の対比染色、図2のように使用される一次および二次抗体。
Discussion
冷凍保存は、将来の使用のために銀行貴重な脳組織のサンプルをする機会を提供しています。ここでは、ニューロンの濃縮培養と凍結脳組織ブロックからの神経前駆細胞の両方を生成するために単純だが効果的なプロトコルを記述する。この経済的な手順は、より高価な速度制御の冷凍庫を利用する従来の凍結保存技術のコストを回避することができます。プロトコルは、実行可能なニューロン培養組織ブロックを凍結する迅速な、まだ効果的な手段を提供することにより、後の融解の発生することができます。全体凍結のプロセスは、わずか20分かかることがあります。一次ニューロン培養に加えて、このメソッドは組織ブロックを使用しても、自由に浮遊ロスフェアとして成長NPCを生成するために解凍することができます。この点で、私たちの凍結培地中の血清の不足は、細胞が未分化状態で維持されることが保証されます。差別化の条件下では、ニューロスフェアは、凍結組織ショーの拡大と、新鮮な組織から生成されたニューロスフェアへの非常に匹敵する分化率から生産。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、UCIの学部研究機会プログラムからの補助金（ARとSP）とカリフォルニアアルツハイマー病のイニシアティブと保健助成金の国民の協会がないの国からの補助金によって支えられて。 HD38466、およびアルツハイマー病研究センターは付与しない。 AG16573（JB）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
