Summary
Здесь мы опишем метод для эффективной криоконсервации и размораживания корковые блоки ткани мозга для получения обогащенного нейронных культур. Это простой протокол обеспечивает гибкость для последующего поколения нейронов, астроцитов и нейронов культур предшественников клеток.
Abstract
В этом исследовании мы опишем стандартизированный протокол для успешной криоконсервации и размораживания корковых блоков ткани мозга для получения обогащенного нейронных культур. Для этого протокол замораживания среда, используемая на 10% диметилсульфоксида (ДМСО) разводят в буферизацией солевом растворе Хэнка (HBSS). Блоки корковой ткани передаются криопробирки содержащие замораживания средних и медленно замораживали при -1 ° С / мин в скорости контролируемого замораживания контейнер. После оттепели обработки и диссоциации замороженных блоков ткани производятся последовательно нейронов обогащенного культур, которые выставлены быстрый рост neuritic в течение первых 5 дней в культуре и значительное расширение нейронной сети в течение 10 дней. Иммуноцитохимическая окрашивания астроцитарных Маркер глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и нейронных маркером бета-тубулина III класса, показал большое число нейронов и астроцитов в культуре. Поколение нейронных предшественником клеточных культурах тканей после блока диссоциации в результате быстро развивающейся нейросферы, который к появлению большого количества нейронов и астроцитов при дифференциации условий. Это простой протокол криоконсервации позволяет быстрое, эффективное и недорогое сохранение корковых блоков ткани головного мозга, которая предоставляет повышенную гибкость для последующего поколения нейронов, астроцитов и нейронов культур предшественников клеток.
Protocol
1. Криоконсервация корковые блоки ткани
Подготовка материала
- Подготовка буферизацией солевой раствор 1X Хэнка (HBSS) путем разведения в 10 раз маточного раствора в стерильной воде (1:9). Магазин HBSS при температуре 4 °.
- Подготовка 10% ДМСО замерзания среды путем разбавления ДМСО в HBSS (1:9). Замораживания среда должна быть свежей, прежде чем криоконсервация и хранили при 4 ° С до охлажденным.
- Стальным лезвием бритвы используется для систематического измельчения ткани. Перед использованием лезвие стерилизуют погружением в 70% этаноле в течение 2 часов. Непосредственно перед обработкой ткани, промыть лезвие стерильной водой в 3 раза. Не оставляйте бритвой в стерильной воды для чрезмерное количество времени, так как он подвержен окислению.
- Контейнер Nalgene замораживания загружается с криопробирки (2,5 мл), а затем привести в стерильных биологических кабинета. 1 мл охлажденной замерзания среды добавлены в каждом флаконе. Замораживания контейнер помещается на 4 ° С не менее 2 часов.
Уборка, Измельчение, и морозильные
- Мозговой ткани должны быть заморожены очищается от менингеальные оболочки и кровеносные сосуды. Используйте стерильные иглы советы, чтобы тщательно удалить мусор из ткани во время работы в верхней части лед. Очищенные ткани должны быть промыты слегка с холодным HBSS и переведен в новую чашку Петри для измельчения.
- Работа на вершине льда, используйте стерилизовать лезвие быстро нарезать ткани в 1 мм 3 блока. Работа с небольшими порциями очищенных тканей в то время, приводит к улучшению контроля над процедурой измельчения, что приводит к более равномерному размеры блоков.
- Медленно добавьте нарезанный ткани в 50 мл HBSS в 50 мл коническую трубку. Аккуратно промойте чашки Петри с HBSS, чтобы собрать все оставшиеся блоки ткани. Разрешить ткань блокирует спуститься на дно пробирки, создавая неплотно упакованные ткани блок гранул.
- В то время как ткани урегулирования, довести ранее охлажденное замораживания контейнер и криопробирки в кабинете биологической безопасности. Открывать все криопробирки, чтобы ускорить процесс добавления ткани.
- После того как все блоки ткани осели, мягко аспирации избыточного HBSS, оставляя очень тонкий слой СМИ выше гранул. Центрифугирование не рекомендуется поскольку это вызовет ткани блоков прилипать друг к другу, что значительно уменьшается эффективность замораживания.
- Медленно собирать 200 мкл со дна рыхлой ткани блок гранул с помощью пипетки с широкими отверстиями (вырезать наконечник стерильными ножницами). Передача материала одного криопробирку и перейти к следующему, снова собирать ткань со дна осадок. Важно, чтобы вся процедура распределения ткани не займет более 3-4 мин на замораживание контейнера. Это гарантирует, что ткань подвергается ДМСО только в течение короткого периода времени до замерзания. После переноса ткани на флаконах, место замораживания контейнер в морозильной камере-80 ° С в течение 4 часов. Кроме того, замораживание контейнер может быть оставлена на ночь при -80 оС. Повторите эту процедуру для всех оставшихся контейнеров замораживания.
- Передача криопробирки от замораживания контейнер (ы) для cryobox и поместить в резервуар жидкого азота для долгосрочного хранения.
2. Размораживание и Культивирование Замороженные корковые блоки ткани
Подготовка материала
- За день до оттаивания образцов тканей, поли-L-лизин покрытием чашки Петри / покровные готовы. В общем, для нейронов коры мы готовим блюда с покрытием 500 мкг / мл или 1 мг / мл. Добавьте достаточно поли-L-лизин решение (сделанные в буфере бората), чтобы полностью покрыть дно тарелки. Если стекла покровные требуется, чтобы они были полностью погружены в поли-L-лизин решение. Инкубируйте в течение 12 часов. Перед употреблением тщательно промойте блюда с либеральным количеством стерильной воды 3 раза, 5 минут каждый.
- Теплый HBSS используется для очистки талых ткани, а также отделить ткани в суспензии клеток. Объем HBSS необходимо будет варьироваться в зависимости от количества ткани, которая будет оттаять, но, как правило 1 криопробирку будет разбавлять в 50 мл HBSS и будет рассматриваться в отрыве в 10 мл HBSS.
- Измененный Дульбеко Eagle среде с 10% железа дополнен бычьей сыворотки теленка (EBS) и 1% антибиотик / противогрибковым (AA) смеси (DMEM (++)) должны быть помещены в 37 ° С водяной бане.
- Покрытие среды (NB (+++)) должны быть свежими перед использованием. Эта среда готовится путем добавления 1% антибиотик / противогрибковым плюс B27 и N2 добавок.
Примечание: Media имена добавляются с крестами (+) указывают на включение добавок к базовому составу средств массовой информации. В этом тексте, DMEM (+ +) обозначает DMEM плюс 10% EBS плюс 1% А.А., в то время как NB (+++) обозначает NB плнам 1% А. А. плюс B27 плюс N2.
Размораживание и культивирования
- Удалить из криопробирки резервуар жидкого азота и быстро таять при температуре 37 ° С на водяной бане, пока только небольшой ледяной шарик наблюдается внутри флакона содержимое.
- Аккуратно передачи флакон 50 мл с содержанием теплого HBSS в конической трубе. Используйте широкий кончик отверстие аккуратно выбить любые оставшиеся ткани блоков застрял в криопробирку. Обратить трубки в 3-4 раза и позволяет ткани медленно собирают на дне. Ткани должны решить быстро, но если блоки слишком малы, это не может произойти и легкой центрифугирования (~ 200 х г) рекомендуется.
- Аспирируйте избыток HBSS.
- Добавьте 10 мл теплой HBSS к ткани гранул и 300 мкл 0,25% трипсина и 50 мкл ДНК-азы. Инкубируйте в 37 ° С водяной бане в течение 5 мин, затем поместить в орбитальный шейкер установлен на 80 оборотов в минуту и 37 ° С в течение еще 5 мин.
- По истечении этого срока, принести ткани блоков в кабинете биологической безопасности и использовать 10 мл пипеткой тщательно перемешивать, пока ткань блокирует облачно суспензии клеток образуется. Отключить трипсина путем добавления 10 мл теплой DMEM (+ +) к клеточной суспензии.
- Центрифуга диссоциированных клеток при 1200 х г в течение 5 мин. Аспирацию и отбросить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 10 мл теплой DMEM (+ +) и количественного числа клеток использованием гемоцитометра.
- Пластина клеток на поли-L-лизин покрытием блюд. Как правило, 60-мм блюдо будет с гальваническим покрытием 1х10 6 клеток.
- Разрешить клеткам прикрепляться к блюду / покровные примерно 1 час в культуре ткани инкубатора. Рекомендуется следить за ходом вложение в одну пластину каждые 10 мин до эффективное вложение не наблюдается. Затем, аккуратно заменить свежей среды с DMEM (++).
- Через 24 ч, заменить DMEM (+ +) с теплым NB (+++). Частичные изменения среды (50%) проводятся каждые 5 дней со свежими NB (+++). Здоровый культур обычно показывают признаки дифференциации и роста процессов после 24 часов. В этих условиях, и выполняя частичные изменения среды каждые 4-5 дней, культуры может поддерживаться в течение длительного периода времени до 4-6 недель.
- Для поколения нейронных клеток-предшественников (NPC), аналогичный протокол используется с тем исключением, что после центрифугирования, DMEM без EBS используется. Клетки помещали в Т-25 колб в DMEM/F12 (1:3) с добавлением B27 и ЭФР (20 нг / мл), чтобы образование neuropheres. Чтобы дифференцировать NPC, нейросферы высевали на ламинин (10 мкг / мл), покрытых покровных в DMEM/F12 (1:3) среде, дополненной N2.
3. Представитель Результаты
Здоровый культур покажет значительный рост и дифференцировку через 5 дней после оттаивания и, как правило, стабилизируется в своем росте на 10 дней (рис. 1). Immuncocytochemical окрашивания этих культур выявляет многочисленные астроцитов (рис. 2А) и нейронов (рис. 2Б) как для человека и крысы первичных нейронов культур. Этот протокол также подходит для поколение NPC, как свободно плавающего нейросферы (рис. 3А), которые при дифференциации условий, приводит к высокому качеству смешанных культур (рис. 3B, C).
Рисунок 1. Клеточные культуры замороженного человека корковой ткани. Замороженные человека корковые блоки ткани талых и высевают на поли-лизин покрытием покровные и выращивали в течение 10 дней. Днем 5 клеток расширения видно и по 10-й день слияния достигнута. Шкала бар: 100 мкм.
Рисунок 2. Иммуноцитохимическая окрашивания клеточных культурах. () Культур окрашивали глиальных Маркер глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP, толстые стрелки). (B) нейроны были обнаружены с нейронный маркер бета-тубулина III (TIII, тонкие стрелки). (C) Оба человека и крысы культур показывают, обильные глии и нейронов через 10 дней в культуре. Первичные антитела: анти-мышь GFAP (1:1000) и кролика против TIII (1:1000). Вторичные антитела: анти-мышь Alexa 594 (1:500) и анти-кролик Alexa 488 (1:500). Окрашивание ядер: Hoestch синий (1:1000). Шкала бар: 50 мкм.
Рисунок 3. Генерация нейросферы. () Замороженные ткани были обработаны, как описано выше и позволило распространяются как нейросферы. (B) нейросферы высевали на покровные стекла при дифференциации условий и выращивали в течение 10 дней, в результате чего клетки мигрируют от neurosphere. (C) Оба нейроны и астроциты присутствуют в расширении краю дифференциации neurosphere. Ядерная counterstaining, первичные и вторичные антитела используются как на рис 2.
Discussion
Криоконсервация дает возможность банку драгоценные ткани мозга образцы для использования в будущем. Здесь мы опишем простой, но эффективный протокол для создания как нейрон обогащенного культур и нейронных клеток-предшественников из замороженных блоков ткани мозга. Эта экономичная процедура позволяет избежать расходов на традиционные методы криоконсервации, которые используют более дорогие ставки контролируемых морозильников. Протокол позволяет поколения жизнеспособных нейронов культур после оттаивания, обеспечивая быстрое еще эффективное средство для замораживания тканей блоков. Весь процесс замораживания может занять всего 20 минут. В дополнение к основной культуры нейронов, с помощью этого метода блоков ткани также может быть талой для создания НПС выращивают как свободное плавание нейросферы. В этой связи отсутствие сыворотки в нашей среде замораживания гарантирует, что клетки сохраняются в недифференцированное состояние. Под дифференциации условий, нейросферы производится из замороженного расширения шоу ткани и дифференциации ставки очень сопоставимы с нейросферы генерируется из свежей ткани.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами Программа студенческого Исследовательские возможности в UCI (AR и SP) и грантов от государства болезней инициатива Калифорнии Альцгеймера и Национального института здоровья грант №. HD38466, и Болезнь Альцгеймера исследовательский центр грант №. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
