Frysförvaring av kortikal vävnad block för generering av höganrikat Neuronal kulturer

Summary

Här beskriver vi en metod för effektiv frysförvaring och upptining av kortikala block hjärnvävnad att generera höganrikat neuronala kulturer. Denna enkla protokoll ger flexibilitet för senare generation av neuronala, astrocyternas och neuronala kulturer föregångare cell.

Abstract

I denna studie beskriva vi ett standardiserat protokoll för det framgångsrika frysförvaring och upptining av kortikala block hjärnvävnad att generera höganrikat neuronala kulturer. För detta protokoll frysning medium som används är 10% dimetylsulfoxid (DMSO) utspädd i Hanks buffrad saltlösning (HBSS). Block av kortikal vävnad överförs till cryovials innehåller frysning medium och långsamt frysas vid -1 ° C / min i en takt kontrollerad frysning behållare. Post-tina bearbetning och dissociation av frysta vävnads block konsekvent producerade neuronala-berikade kulturer som visade snabb neuritic tillväxt under de första fem dagarna i kultur och betydande utvidgning av det neuronala nätverket inom 10 dagar. Immuncytokemiska färgning med astrocytic markör gliaceller fibrillära surt protein (GFAP) och neuronala markör beta-tubulin klass III, visade ett stort antal nervceller och astrocyter i de kulturer. Generering av neurala kulturer föregångare cellen efter vävnaden blockera dissociation resulterat i snabbt växande neurospheres, som producerade ett stort antal nervceller och astrocyter i differentierande förhållanden. Denna enkla frysförvaring protokollet möjliggör för en snabb, effektiv och billig bevarande av kortikal block hjärnvävnad, vilket ger ökad flexibilitet för senare generation av neuronala, astrocyternas och neuronala kulturer föregångare cell.

Protocol

1. Frysförvaring av kortikal vävnad Blocks

Material Förberedelser

1. Bered 1x Hanks buffrad saltlösning (HBSS) genom att späda på 10X stamlösning i sterilt vatten (1:09). Förvara HBSS vid 4 grader Celsius.
2. Förbered 10% DMSO frysning medelstora genom att späda DMSO i HBSS (1:09). Frysning medium bör göras färsk innan frysförvaring och förvaras vid 4 grader Celsius fram till kyld.
3. En stål rakblad används för systematisk hugga av vävnad. Innan användning, rakbladet steriliseras genom nedsänkning i 70% etanol i 2 tim. Omedelbart före vävnad bearbetning, skölj rakbladet med sterilt vatten 3 gånger. Undvik att lämna rakkniv i sterilt vatten för en alltför lång tid, eftersom det är utsatt för oxidation.
4. En Nalgene frysning container är lastad med cryovials (2,5 ml) och sedan förs in i en steril biologiska skåp. 1 mL kylda frysning mediet läggs till varje flaska. Frysning behållaren placeras sedan vid 4 grader Celsius i minst 2 timmar.

Rengöring, Hacka, och frysning

1. Hjärnvävnaden som skall frysas städas av meningeal membran och blodkärl. Använd steril nål tips för att försiktigt ta bort skräp från vävnaden samtidigt som du arbetar på toppen av en kylpåse. Rengjord vävnad bör sköljas försiktigt med kallt HBSS och överföras till en ny petriskål för att hacka.
2. Att arbeta på toppen av en ispåse, använd ett steriliserat rakblad för att snabbt hacka vävnaden till ca 1 mm ³ kvarter. Arbeta med små portioner av rengjorda vävnaden vid en tidpunkt leder till bättre kontroll över hugga förfarande, vilket resulterar i jämnare blockstorlekar.
3. Tillsätt långsamt hackad vävnad till 50 mL HBSS i en 50 ml koniska rör. Försiktigt skölja petriskål med HBSS för att samla in eventuella kvarvarande vävnad block. Låt vävnaden block för att gå ner till botten av röret, vilket skapar en löst packad vävnad blocket pellets.
4. Medan vävnaden är lösa, ta med den tidigare kylda frysning behållare och cryovials i biologisk säkerhet skåp. Ta bort skyddet alla cryovials att påskynda processen att lägga vävnad.
5. Efter alla vävnaden block har slagit sig försiktigt aspirera överskottet HBSS och lämnar ett mycket tunt lager av media över pelleten. Centrifugering motverkas eftersom det kommer leda till att vävnaden block för att hålla sig till varandra, vilket avsevärt minskar frysning effektivitet.
6. Sakta samlar 200 mikroliter från botten av den lösa vävnaden blocket pellets med hjälp av pipettspetsen med breda öppningar (klipp spets med steril sax). Överför materialet till en cryovial och gå vidare till nästa, återigen samla vävnad från botten av pellets. Det är viktigt att hela vävnaden tilldelningsförfarandet inte ta mer än 3-4 minuter per frysning container. Detta säkerställer att vävnaden utsätts för DMSO endast en kort tid före frysning. Efter överföring av vävnaden till rören, placera frysning behållaren i en--80 ° C frys i minst 4 timmar. Alternativt kan frysa behållaren lämnas över natten vid -80 oC. Upprepa denna process för eventuella återstående frysning behållare.
7. Överför cryovials från frysning container (s) till ett cryobox och placera i en flytande kväve tank för långtidsförvaring.

2. Upptining och odling av Frozen kortikala Tissue Blocks

Material Förberedelser

1. En dag före upptining vävnadsprover, _poly-L-lysin belagd petriskålar / täckglas är beredda. I allmänhet för kortikala neuroner vi förbereda belagda rätter med 500 mikrogram / ml eller 1 mg / ml. Lägg tillräckligt med _poly-L-lysin lösning (som görs i boratbuffert) för att helt täcka botten av skålen. Om glaset täckglas krävs, se till att de är helt under vatten under _poly-L-lysin lösning. Inkubera i minst 12 tim. Före användning, skölj disken med en liberal mängd sterilt vatten 3 gånger, 5 min vardera.
2. Varm HBSS används för att rengöra tinas vävnad samt att skilja vävnaden i cellsuspensioner. Volymen som behövs HBSS kommer att variera beroende på hur mycket vävnad som ska tinas, men vanligtvis 1 cryovial kommer att späda i 50 ml HBSS och kommer att skilja i 10 ml HBSS.
3. Dulbecco ändrade Eagle Medium med 10% järn kompletteras bovint kalvserum (EBS) och 1% antibiotika / antimykotika (AA) blandning (DMEM (++)) ska placeras i en 37 ° C vattenbad.
4. Plätering medium (bör NB (+++)) göras färska före användning. Detta medium är förberett genom att lägga till 1% antibiotika / antimykotika plus B27 och kosttillskott N2.

Obs: Media namn bifogas med kors (+) indikerar att införa tillsatser till basen sammansättningen av media. I denna text, DMEM (+ +) betecknar DMEM plus 10% EBS plus 1% AA, medan NB (+++) betecknar NB ploss 1% AA plus B27 plus N2.

Upptining och Odling

1. Ta bort cryovials från flytande kväve tanken och snabbt tina i 37 ° C i ett vattenbad tills bara en liten is pellets observeras inne i flaskan innehåll.
2. Försiktigt överföra flaskan innehåll till 50mL av varma HBSS i en konisk tub. Använd en bred öppning tips till försiktigt loss eventuella kvarvarande vävnad block fastnat i cryovial. Vänd röret 3-4 gånger och låt vävnaden sakta samla på botten. Tissue bör lösa snabbt, men om blocken är för små så inte kan ske och lätt centrifugering (~ 200 x g) rekommenderas.
3. Aspirera överskott HBSS.
4. Tillsätt 10 ml varmt HBSS till vävnaden pelleten och 300 mikroliter av 0,25% trypsin och 50 mikroliter av DNAase. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 5 min, sedan plats i en skakapparat inställd på 80 rpm och 37 ° C i ytterligare 5 min.
5. Efter denna period föra vävnaden block ner en biologisk säkerhet skåp och använda en 10 ml pipett att noga agitera vävnaden blocken tills en grumlig cellsuspension bildas. Avaktivera trypsin genom att tillsätta 10 ml varmt DMEM (+ +) till cellsuspension.
6. Centrifugera dissocierade celler vid 1200 x g i 5 minuter. Aspirera och kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml varmt DMEM (+ +) och kvantifiera mobilnummer med hjälp av en hemocytometer.
7. Tavla celler _poly-L-lysin belagda rätter. Vanligtvis kommer ett 60-mm maträtt beläggas med 1x10 ⁶ celler.
8. Låt cellerna att fästa skålen / täckglas i ca 1 timme i vävnadsodling inkubatorn. Det rekommenderas att övervaka utvecklingen av bilagan i en tallrik var 10 min tills effektiv fastsättning observeras. Sedan försiktigt ersätta mediet med färska DMEM (++).
9. Efter 24 timmar, byt DMEM (+ +) med varmt NB (+++). Partiell medelstora förändringar (50%) görs varje 5 dagar med färska NB (+++). Friska kulturer brukar visa tecken på differentiering och tillväxt av processer efter 24 timmar. Under dessa förhållanden, och utföra partiella medelstora förändringar varje 4-5 dagar, kan de kulturer upprätthållas under längre perioder på upp till 4-6 veckor.
10. För generering av neuronala föregångare celler (NPC), är ett liknande protokoll som används med undantag för att efter centrifugering är DMEM utan EBS används. Celler är pläterade i T-25 kolvarna i DMEM/F12 (1:3) kompletterat med B27 och EGF (20 ng / ml) för att möjliggöra bildandet av neuropheres. För att skilja NPC: er, är neurospheres pläterade på laminin (10 ug / ml) bestruket täckglas i DMEM/F12 (1:3) mediet kompletteras med N2.

3. Representativa resultat

Friska kulturer kommer att visa betydande tillväxt och differentiering efter 5 dagar efter upptining och kommer vanligtvis att stabiliseras under sin tillväxt med 10 dagar (Figur 1). Immuncocytochemical färgning av dessa kulturer avslöjar många astrocyter (Figur 2A) och neuron (figur 2B) för både människa och råtta primära neuronala kulturer. Detta protokoll är också lämplig för generering av NPC: er som fritt flytande neurospheres (Figur 3A), som enligt skilja förhållanden resulterar i hög kvalitet blandade kulturer (Figur 3B, C).

Figur 1. Cellkulturer av frysta mänskliga kortikal vävnad. Frysta mänskliga kortikal vävnad block tinas och pläterade på poly-lysin belagda täckglas och odlas i 10 dagar. Vid dag 5 cell expansion är uppenbar och dag 10 confluency uppnås. Skala bar: 100 ìm.

Figur 2. Immuncytokemiska färgning av cellkulturer. (A) kulturer färgades med gliaceller markör gliaceller fibrillära surt protein (GFAP, tjocka pilar). (B) Nervceller upptäcktes med neuronala markör beta-tubulin III (TIII, tunna pilar). (C) Både människor och kulturer råtta visar riklig Glia och nervceller efter 10 dagar i kulturen. Primära antikroppar: mus-anti-GFAP (1:1000) och kanin anti-TIII (1:1000). Sekundära antikroppar: anti-mus Alexa 594 (1:500) och anti-kanin Alexa 488 (1:500). Nuclei färgning: Hoestch blå (1:1000). Skala bar: 50 ìm.

Figur 3. Generering av neurospheres. (A) Fryst vävnad bearbetades enligt ovan och får möjlighet att sprida så neurospheres. (B) Neurospheres var klädd på glas täckglas i differentiera förhållanden och som odlas för 10 dagar, vilket resulterar i celler flyttar bort från neurosphere. (C) både nervceller och astrocyter finns i den växande utkanten av en differentiering neurosphere. Nuclear motfärgning, primära och sekundära antikroppar använts som i figur 2.

Discussion

Frysförvaring erbjuder en möjlighet att banken dyrbara prover hjärnvävnad för framtida bruk. Här beskriver vi ett enkelt men effektivt protokoll för att generera både neuron-berikade kulturer och neuronala celler föregångare från frysta block hjärnvävnad. Denna ekonomiska förfarande undviks kostnader för traditionella frysförvaring tekniker som utnyttjar dyrare takt kontrollerade frysar. Protokollet gör det möjligt för generering av livskraftiga neuronala kulturer efter upptining genom att ge en snabb men ändå effektivt sätt att frysa vävnaden block. Hela frysa processen kan ta så lite som 20 minuter. Utöver primära neuronala kulturer, kan använda denna block metod vävnad också tinas att generera NPC odlas som flytande neurospheres. I detta avseende ser avsaknaden av serum i vår frys medium som cellerna finns bevarade i en odifferentierad stat. Under skilja förhållanden, produceras neurospheres från fryst vävnad visa expansion och priser differentiering helt jämförbar med neurospheres genereras av färsk vävnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995-073	High gluclose 1X
Bovine calf serum supplemented	Hyclone	SH30072.03	For culture medium
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	Invitrogen	1088-022
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044	Supplement for Neurobasal medium
N2 Supplement	Invitrogen	17502-048	Supplement for Neurobasal medium
Trypsin (10X)	Cellgro	25-054CI	Tissue dissociation
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)	Sigma-Aldrich	D4527-30KU	Tissue dissociation
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)	GIBCO, by Life Technologies	14065	Cleaning tissue, washes, and freezing medium
Poly-L-Lysine- 500mg	Invitrogen	P2636	Substrate for adhesion of neuronal cells
antibiotic-antimycotic (100X), liquid	Invitrogen	15240-062	To prevent contamination
Large orifice pipette Tips (1-200 ul)	Fisher Scientific	02-681-141	To prevent shear stress to cells
Graduated pipette tips (101-1000 ul)	USA Scientific, Inc.	1111-2721
21 G1 precision guide needles	BD Biosciences	305165	To clean tissue
10 ml pipette	USA Scientific, Inc.	1071-0810	Individually wrapped
50 ml tubes	USA Scientific, Inc.	926-9-04
Single edge razor blade	Smith & Nephew Inc.	67-0238	To chop tissue
60 x 15 mm polystyrene petri dish	USA Scientific, Inc.	8609-0160	For general culture
100 x 15 mm polystyrene petri dish	USA Scientific, Inc.	8609-0010	For cleaning tissue
Cryogenic box	Nalge Nunc international	5026-1010
Freezing container	Nalge Nunc international	5100-0001	"Mr. Frosty"
2.0 ml cryogenic vials	Nalge Nunc international	5012-0020
DMSO	Fisher Scientific	D128-500	For freezing medium
Ethanol 200 proof	Sigma-Aldrich	E7023	For sterilizing razor blade