Summary
نحن هنا وصفا للمقايسة التي توظف قوة microinjection مقرونا الفلورسنت
Abstract
في حقيقيات النوى ، وكتب رسول الحمض النووي الريبي (الرنا) في النواة ، ويجب أن يتم تصديرها إلى السيتوبلازم للوصول إلى آلية الترجمة. على الرغم من انه تمت دراسة تصدير المواد النووية من مرنا نطاق واسع في البويضات القيطم 1 لين العريكة وراثيا والكائنات مثل الخميرة (2) وذبابة الفاكهة المستمدة خط S2 الخلية 3 ، وقد أجريت دراسات قليلة في خلايا الثدييات. وعلاوة على ذلك يمكن فقط حركية التصدير مرنا في الخلايا الجسمية الثدييات يمكن الاستدلال 4،5 بشكل غير مباشر. من أجل قياس حركية تصدير المواد النووية من خلايا الثدييات مرنا في زراعة الأنسجة ، وطورنا مقايسة التي توظف قوة microinjection مقرونا فلوري التهجين في الموضع (FISH). وقد استخدمت هذه المقايسات لإثبات أن في خلايا الثدييات ، ويتم تصدير معظم mRNAs بطريقة تعتمد على الربط 6،7 ، أو في الطريقة التي تتطلب تسلسل الحمض النووي الريبي معينة مثل الإشارة المنطقة تسلسل الترميز (SSCR) 6. في هذا الاختبار ، يتم microinjected الخلايا في المختبر إما مع مرنا توليفها أو DNA البلازميد الذي يحتوي على الجينات في المصالح. يتم تحضين الخلايا microinjected للحصول على نقاط زمنية مختلفة ومحددة ثم يتم تقييم الترجمة شبه الخلوية باستخدام الحمض النووي الريبي من الأسماك. على النقيض من ترنسفكأيشن ، حيث النسخ تحدث عدة ساعات بعد إضافة الأحماض النووية ، microinjection من الحمض النووي أو مرنا يتيح للتعبير السريع ويسمح لتوليد البيانات الحركية الدقيقة.
Protocol
هناك طرق microinjection مقرا لهما والتي يمكن استخدامها لقياس حركية التصدير مرنا في خلايا الثدييات ؛ حقن في المختبر مرنا توليفها ، أو DNA البلازميد ، وهو كتب في الجسم الحي في مرنا. كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. نحن هنا وصف كل التقنيات ومناقشة الاختلافات بين النهجين.
1. إعداد مواد للحقن
- كتب مرنا في المختبر
- هو كتب مرنا إما من البلازميدات PCR أو المنتجات التي تحتوي على جينات من مصلحة يحيط المنبع من المروج المناسبة بوليميريز الحمض النووي الريبي (اي T7 أو المروجين SP6). يتم تنفيذ النسخ في المختبر باستخدام انزيم المناسب (T7 أو SP6 بوليميريز الحمض النووي الريبي ، Invitrogen) مع النيوكليوتيدات المناسبة وزيادة الغطاء التماثلية.
- ومذيل بعديد الأدينيلات محاضر في المختبر باستخدام بولي - A - بوليميريز (Invitrogen) وبطولة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- ومرنا تتم تنقيته ثم استخدام الأعمدة إما من Invitrogen أو Qiagen.
- وعجلت ثم مرنا Eluted بإضافة البوتاسيوم 1/20th 3M خلات حجم وحدات التخزين 2 من الإيثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة يليها الطرد المركزي في ز 13000 في 4 درجة مئوية لمدة 30min. إذا كان السائل الزائد موجودا ، يمكن غسلها مع بيليه الايثانول الباردة الجليد 70 ٪.
- الناتج بيليه مرنا تجفف solubilised ثم حقن الهواء في المخزن (140mM بوكل وHEPES 10MM ، ودرجة الحموضة 7.4). علما أن أي الإيثانول الملوثات قد تكون سامة للخلية microinjected. ويمكن أن تظل مرنا في solubilized -80 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين.
- لmicroinjection ، هو المخفف مرنا ل200μg/ml العازلة في الحقن ومختلطة مع الأخضر ولاية أوريغون 488 (خطأ في مرماه) ، مترافق 70kDa ديكستران (1mg/ml ؛ Invitrogen). منذ ديكستران OG - مترافق كبير جدا لنشر عبر المسام النووية ، فإنه لا يمكن لاحد فقط لتحديد الخلايا حقن ، ولكن أيضا أن يساعد على تحديد كيفية الكثير من السوائل وحقن نواة وكم تسربت الى السيتوبلازم ( انظر 4.1.2). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أي وارتفاع الوزن الجزيئي الفلورسنت جزيء غير قادر على اجتياز المسام النووية.
- وطرد في عينات ز 13000 في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل 20min قبل التحميل الإبرة من أجل بيليه الجسيمات التي يمكن أن تعرقل أي طرف يحتمل الإبرة.
- البلازميد الحمض النووي
- يمكن إعداد ال DNA البلازميد الذي يحتوي على الجينات ذات الاهتمام باستخدام معيار تنقية مجموعات من الحمض النووي من Qiagen. الاستعدادات الحمض النووي أكبر عموما تميل الى ان تكون ذات جودة أعلى وبالتالي هي أكثر كفاءة كتب بعد الحقن.
- غير المخفف DNA البلازميد 50 إلى 200μg/ml العازلة في الحقن التي تحتوي على 70 خطأ في مرماه ، مترافق ديكستران كيلو دالتون (1mg/ml).
- قبل التحميل الإبرة ، يتم حقن السائل طرد 13000 في غرام عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل 20min.
- إبر للmicroinjection
- هي ملفقة من الإبر 1.0mm أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية (البند # 1B100F - 3 ؛ الدقة العالم آلات شركة) باستخدام سوتر p97 يلهب / براون Micropipette بولير مع خيوط 2.5mm.
- يتم إنشاء إبر الحقن باستخدام برنامج من ثلاث خطوات سحب باستخدام مربع مم 2.5x4.5 خيوط (البند رقم FB245B ، سوتر الصك شركاه). يتم سرد معلمات البرنامج المستخدم في هذه التجربة أدناه ، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل لكل ما خيوط.
الخطوة # حرارة سحب سرعة مرة الضغط 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500
(درجة الحرارة منحدر = 740)
- إعداد الخلية
- عموما يمكن microinjected أي خط خلايا الثدييات ، ولكن أنواع الخلايا التي تنتشر بشكل جيد تميل الى أن تكون أكثر استعدادا للحقن. قد اختيار خط الخلية يعتمد أيضا على عوامل أخرى. على سبيل المثال ، mRNAs التي تستهدف رمز للبروتينات يفرزها على سطح الشبكية هيولي باطني وهذا هو أكثر وضوحا بكثير في الخلايا COS - 7 بالمقارنة مع المعاهد الوطنية للصحة الخلايا الليفية 3T3 6 (مقارنة توطين المنطقة الحرة برأس - T - Δi مرنا في أرقام 3 و 4).
- وينبغي على الخلايا المصنف حمض غسلها coverslips مربع (25x25mm) في petridishes 30mm على الأقل قبل microinjection 24hrs. في خطوط خلايا معينة ، يمكن أن ينتشر عن طريق تحفيز الخلايا المغلفة الطلاء على coverslips فبرونيكتين 6،8. من الناحية المثالية ينبغي أن يكون أحادي الطبقة الخلوية حوالي 70-90 ٪ متكدسة في وقت الحقن.
- للسماح لسهولة تحديد الخلايا حقن ، والجرحى المونولاير الخلية قبل الحقن باستخدام ماصة بلاستيكية 200μl الحافة. هو عموما جرحا محفورا عبر (الشكل 1) على ساترة وتترك الخلايا لاسترداد ما لا يقل عن 15min قبل الحقن في أنسجة حاضنة الثقافة.
- microinjection خلال وسائل الاعلام زراعة الأنسجة يفقد ببطء CO 2 إلى نشر ونتيجة لذلك يصبح من القلويات. للمساعدة في المحافظة على درجة حموضة محايدة خلال الحقن ، ويمكن استكمال وسائل الاعلام مع HEPES 10MM 7.4 درجة الحموضة. يمكن إضافة العازلة اضافية لوسائل الإعلام قبل يوم microinjection.
- المجهر وMicromanipulator
- وmicroinjected الخلايا باستخدام مجهر مقلوب معزولة على جدول الهواء لتقليل الاهتزازات التي يمكن أن تكون مدمرة لعملية microinjection. وقد تم تجهيز المجهر مع اثنين من الأهداف ؛ قطعة جافة 10X ، والذي يستخدم لوضع الخلايا وإبرة ، و40X اضافية الجافة العمل الطويلة المسافة هدف المرحلة ، والذي يستخدم لصورة عملية microinjection.
- يمكن القضاء على الانحرافات البصرية التي تسببها خلايا يعاينون عبر ساترة petridish وإذا كان الهدف قد طوق تصويب. ضمان أن يتم محاذاة صحيح brightfield المجهر لإنارة 9 كولر ، وسوف يساعد أيضا على تصحيح الانحرافات التي يسببها الضوء المستطير بواسطة إبرة الحقن (انظر 2.2.4).
- يتم التحكم بواسطة إبرة ثلاثة محاور شنقا عصا التحكم الجهاز المجهرية (NT - 88 - V3MSH ، Narishige). يتم تأمين تتلاعب الخشنة الركن الخلفي للمجهر للسماح الإبرة أثار بسهولة وإنزالها في الطبق مع الحفاظ على موقعها الأصلي.
- يتم تأمين الإبرة إلى عصا التي فرضت على تتلاعب الخشنة. أنبوب يربط عصا لحقنة زجاجية 5cc (البند # 512311 ؛ بيكتون ديكنسون) ، الذي يولد الضغط الحقن اللازمة لإخراج السائل من رأس الإبرة microinjection. للتحكم في مستوى الضغط ، وتقام للبرميل ومكبس الحقنة في موقف منظم المحاقن التي تتألف من اثنين من السدادات وأنابيب المشبك (متوفرة في أي متجر لاجهزة الكمبيوتر) ، والمشابك المعدنية اثنين (الشكل 2). للتأكد من أن يحافظ على حقنة الضغط العالي والشحوم فراغ (داو كورننغ) يتم تطبيقها على المكبس المحاقن.
- دقق في تهجين نيون
- يتم طي التسلسل الرئيسي للحمض النووي الريبي باستخدام حقن بنية التنبؤ الثانوية البرمجيات ، مثل RNAstructure 4.6 10.
- ويتم تقييم بصريا طيات مرنا لتعريف المنطقة من حوالي 50 النيوكليوتيدات التي تميل الى ان تكون خالية من الهياكل الثانوية مع درجات حرارة ذوبان عالية ، مثل خيوط مزدوجة طويلة.
- ويتم تصنيع تكملة عكس هذه المنطقة مع fluorophore Alexa546 المرفقة لانهاء 5 'لجنة التحقيق (ويمكن شراؤها من هذه التقنيات المتكاملة DNA).
- هو تمييع التحقيق مع الماء لتركيز 100μM ويتم تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 2-3 سنوات.
2. Intranuclear Microinjection
- تحميل حقن السائل على المجهر microinjection
- ويوجه نحو 1μl حقن السائل من الحمض النووي أو بالطرد المركزي باستخدام عينة مرناGELoader نصائح (البند # 022351656 ؛ Epindorff). وينبغي أن يستنشق السائل من الجزء العلوي من العينة لتجنب عرقلة بيليه الذي يحتوي على الجسيمات التي يمكن أن تسد الإبرة.
- يتم إدراج غيض من ماصة في نهاية الجزء الخلفي من إبر ويتم إخراج السائل. وسوف يوجه إلى الطرف السائل بواسطة إبرة عمل شعري وهلالة قرب الطرف ينبغي أن تكون مرئية داخل 30sec - 5.
- يتم إدخال الإبرة مملوءة بسائل في عصا ، والتي فرضت بعد ذلك إلى micromanipulator بزاوية 45 درجة.
- الإبرة هو تصور مع 10x والهدف هو المتمركزة في مركز للطائرة بالقرب من مشاهدة الطائرة التنسيق باستخدام المقابض micromanipulator الخشنة. ثم يتم رفع الإبرة بضعة ملليمترات لمنعها من التلف في خطوات لاحقة (2.2.2) ثم يتم الضغط على العمود الخلفي المجهر الظهر.
- يتم زيادة الضغط بالضغط على المكبس 0.5 2cc.
- Microinjection
- يتم وضع petridish تتضمن تغطية للانزلاق مع المونولاير الجرحى في مرحلة العرض.
- يتم سحب الركن الخلفي المجهر يتطلع إلى وضع رأسي ، مما تسبب في أن يكون المكثف الانحياز وإبرة لدخول السائل. وينبغي أن يتم ذلك بعناية لمنع الإبرة من كسر على ساترة ل(انظر 2.1.4).
- باستخدام 10X الهدف ، تم تحديد مركز الصليب والجرح يتم وضع إبرة فوق الخلايا المراد حقنها.
- يتم زيادة التكبير عن طريق التحول إلى هدف 40X وخفضت الإبرة ، وتركزت باستخدام المقابض التكيف غرامة على عصا التحكم. إذا كانت الصورة خارج التركيز ، لا بد من ضمان أن يتم محاذاة بشكل صحيح على ضوء حادثة (أي Kölher إنارة 9) باستخدام عدسة برتران (انظر 1.5.2).
- وينبغي أن تبدأ في حقن زاوية واحدة للصليب الجرح واستمر على طول حافة واحدة لسهولة تحديد الخلايا تحقن خلال التصور (انظر الشكل 1).
- وخفضت الإبرة لاجراء اتصالات مع النواة. يمكن للمرء بسهولة أن نقول تم حقن خلية من تغيير ملحوظ في السطوع المرحلة التي ترافق الحقن.
- إذا كان السائل يملأ الخلية بأكملها قد تشير إلى أن الضغط مرتفع جدا ويجب ان تخفض.
- إذا تم الكشف عن أي تغيير في السطوع المرحلة ، قد يشير هذا إلى أنه إما الضغط microinjection ليست قوية بما يكفي لاختراق غشاء الخلية ، أو أن انسداد رأس الإبرة. قد يكون هذا نتيجة لعدد من القضايا من بينها : عدم كفاية الضغط ، وعيوب في الإبرة ، وانسداد رأس الإبرة مع الجسيمات الصغيرة. منذ تحميل كل إبرة في micromanipulator تستغرق وقتا طويلا ، ومنذ الركيزة الحقن غالبا ما تكون قيمة للغاية ، فمن المهم لزيادة النسبة المئوية من الإبر التي يمكن استخدامها بشكل فعال للحقن. هو أقل من خطوة خطوة الدليل لمحاولة كسر الجمود طرف الإبرة المسدودة. بعد كل خطوة ، ينبغي للمرء أن يحاول لحقن 2 - 3cells لتقييم ما إذا تمت إزالة العراقيل :
عمل الغرض والهدف 1 ضبط التركيز على عرض وطول الحافة الإبرة. لتحديد ما إذا كان هناك نقص واضح في إبرة أو ما إذا كان هناك قطعة كبيرة من الجسيمات حجب معلومات سرية. 2 مكان غيض إبرة بجانب قطعة من الجسيمات عائمة في صحن. إذا كان السائل هو الخروج من طرف وينبغي أن تستنهض الهمم والجسيمات دون أن يأتي على اتصال مباشر مع الإبرة. 3 كساد المكبس إلى نهاية جدا من الحقنة هذا يجب زيادة مؤقتة في الضغط في أي عرقلة واضحة على الحافة. بعد الإفراج عن المكبس ، فإنه يجب على ارتفاع تلقاء نفسها ، وإذا لم يحدث ذلك ، يعني هذا الضغط لا يتم المبنية في حقنة وتحتاج إلى تشديد الاتصالات و / أو إضافة إضافية الشحوم فراغ. 4 رفع الإبرة خارج الخلية ميدIA لا يمكن للقوة الرسم الإبرة من الوسط المائي مساعدة ازاحة العراقيل في رأس الإبرة. 5 إزالة المكبس من المحاقن تماما ومعاودة ذلك. قد يكون مطلوبا هذه الزيادة في ضغط إضافية لمسح رأس الإبرة. 6 الصفر طرف الإبرة على جزء نظيف من ساترة مزيد من يحرك هذه الجسيمات داخل الإبرة ويساعد على إعادة وضعه للتخفيف من انسداد في الطرف. قد خدش أقوى رقاقة قبالة نهاية الطرف ، تمكن من عرقلة خروج الإبرة. 7 تحميل إبرة جديدة
مشكلة أخرى شيوعا هو الفقدان التدريجي للضغط داخل الإبرة ، مما يتطلب التعويض المتكرر بالضغط مزيد الغطاس في المحاقن. في كثير من الأحيان ، يمكن إضافة إضافية الشحوم فراغ إلى المكبس حقنة مساعدة في الحفاظ على الضغط أكثر اتساقا. ومع ذلك ، قد تكون هذه المشكلة بسبب تسرب للاتصالات بين حقنة وأنبوب ، أنبوب وعصا ، أو عصا ، وإبرة. يمكن أن تكون مختومة تسرب الهواء باستخدام معظم Parafilm (فيشر) أو الشحوم إذا لزم الأمر ، على الرغم من التسريبات فقط بين العصا والإبرة يمكن تصحيحه عن طريق تغيير طوقا المطاط في عصا. - وmicroinjected الخلايا على طول حافة الجرح على طول حافة الجرح لفترة محددة من الزمن (10 - 15min). يمكن أن يكون للممارسة حقن عدة مئات من الخلايا خلال هذه الفترة.
- بعد microinjection ، يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة حاضنة للمبلغ المطلوب من الوقت قبل التثبيت. إذا حقن الحمض النووي ، ويتم إنهاء النسخ بعد 20min عن طريق علاج الخلايا مع α - أمانيتين (1μg/ml ؛ سيغما الدريخ) المنحل في وسائل النمو. هذا التركيز يمنع فعالية من النسخ البلازميد microinjected (الشكل 3).
- ويمكن إعادة استخدام إبرة واحدة لحقن coverslips متعددة ، على الرغم من أن الإبرة عند الحاجة لاستبداله عندما يكون أحد التغييرات نوع من الحمض النووي الريبي أو أن microinjected. وينبغي أن يتم بعد إزالة الإبرة من عصا يمكن التخلص منها وإعادة استخدامها لا.
- الخلايا الميتة أو العصا العائمة في بعض الأحيان إلى رأس الإبرة ، ويمكن أن تتداخل مع microinjection. لإزالة هذا الحطام من الإبرة ، ورفع إبرة من السائل عن طريق دفع الخلفي الدعامة ثم معاودة ببطء خلف إبرة في السائل من خلال تصحيح العمود إلى الوضع العمودي.
- للحصول على قياس دقيق لمرنا قياس حركية التصدير النووي ، ينبغي ان تكون ثابتة في عينات منفصلة 0min التقييم ، 15min ، 30min 60min ، 120min microinjection وبعد RNA ، أو بعد α - أمانيتين العلاج.
3. التثبيت الخلية ويلطخ
- التثبيت الخلية وPermeabilization
- في الوقت المناسب ، ويستنشق وسائل الإعلام ونمو الخلايا يتم غسلها مرتين مع 2 مل من محلول PBS (137mM كلوريد الصوديوم ، 2.7mM بوكل ، 10MM نا 2 هبو 4 ، 2mm وKH 2 PO 4 ، ودرجة الحموضة 7.4). فمن المهم للحفاظ على coverslips رطبة من خلال تقليل الوقت أنها ليست غارقة في السائل.
- يتم إصلاح الخلايا بإضافة 2ml بارافورمالدهيد من 4 ٪ (العلوم مجهر إلكترون) في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل 15min في درجة حرارة الغرفة.
- يتم غسلها مرتين مع عينات ثابتة حل PBS.
- وpermeabilized الخلايا مع 2ml من 0.1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل العينات مرتين مع الحل برنامج تلفزيوني.
- FISH يلطخ
- القادم العينات تحتاج إلى أن تكون مستعدة لالتهجين. يتم غسلها مرتين مع الخلايا حل SSC 1X (150mM كلوريد الصوديوم ، سترات الصوديوم 15mM ، ودرجة الحموضة 7.0) مع formimide 25-60 ٪. عن مبلغ formamide ، استخدم نفس التركيز التي موجود في الحل التهجين (انظر 3.2.3).
- لإعداد غرفة تلطيخ ، ويغطي الجزء السفلي من petridish 150mm مع الماء ويتم طرح جزء من Parafilm على الماء. هو إزالة المياه من خلال تحويل الطبق أكثر ، وبالتالي السماح للParafilm التمسك قاع الطبق. يتم إعادة يدويا فقاعات الهواءنقل.
- لكل ساترة لتكون ملطخة ، 100μl قطرات من محلول التهجين (25-60 formamide ٪ ، كبريتات ديكستران 100mg/ml ، 1mg/ml القولونية E. الحمض الريبي النووي النقال ، 5mM معقدة riboside vanadyl في محكمة أمن الدولة التحقيق مع 1X المخفف 1:500) هي pipetted وعلى parafilm. علما أنه ينبغي أن يكون الأمثل كمية formamide للمسبار خاص السمكية المستخدمة.
- بمساعدة الملقط ، تتم إزالة ساترة من petridish 30mm ، ثم باستخدام Whatman تصفية الورق (VWR) الجانب الخلفي (الخلية خالية من الجانب) من غير ساترة العازلة المجففة والفائض هو الخبيث من الجانب الأمامي من دون تجفيف الثابتة الخلايا. ثم يتم وضع ساترة وجهها لأسفل على حل السمك. ويتكرر هذا في كل ساترة.
- بعد وضع غطاء غرفة تلطيخ مرة أخرى ، وحضنت العينات المطلوبة لل18hrs - 5 إلى 37 درجة مئوية.
- الغسيل وتركيب العينات الملون
- مصنوعة غرف الغسيل عدة في بنفس الطريقة الغرفة تلطيخ (انظر 3.2.2).
- لكل ساترة ، هو pipetted 1 مل من غسل العازلة (1X SCC مع formamide 25-60 ٪) على parafilm للغرفة الغسيل. مرة أخرى ، استخدم نفس التركيز من formamide التي موجود في الحل التهجين (انظر 3.2.3).
- لإزالة coverslips من غرفة تلطيخ ، 1ml العازلة من غير غسل pipetted بجوار ساترة. وينبغي أن يوجه السائل تحت كل عينة من عمل شعري.
- باستخدام ملقط ، تتم إزالة coverslips ويوضع على كل قطرة من غسل العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- وتتكرر الخطوات ل3.3.2 3.3.4 مرتين أكثر من ذلك ، بحيث يتم غسلها كل ساترة ما مجموعه 3 مرات.
- إذا كان الحمض النووي الريبي هو أن تكون costained مع بعض البروتين المناعي ، انظر القسم 3.4.
- تغسل الشرائح مع الايثانول 70 ٪ ، والمجففة مع Kimwipes. لكل ساترة ، هو pipetted 10-30 ميكرولتر من تصاعد حل مع دابي (Fluoromount G ، جنوب التكنولوجيا الحيوية) على الشرائح. يمكن لكل شريحة استيعاب اثنين coverslips.
- باستخدام الملقط وWhatman رقة الترشيح ، الجزء الخلفي من coverslips هو المجففة والسائلة الزائدة شرير قبالة الجانب الأمامي من دون ساترة تجفيف العينات. ثم يتم وضع كل ساترة وجهها لأسفل ، على الهبوط من الحل في تصاعد مستمر.
- يمكن أن تكون محمولة على عينات المحل في 4 درجات مئوية.
- المناعي يلطخ
- يجب غسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة formamide التي يمكن أن تتداخل مع تلوين الأجسام المضادة المناسبة.
- لكل ساترة ، 50μl الضد من الحل الأساسي (1.0μg/ml الأضداد ، 0.1 ٪ TX - 100 ، 0.1mg/ml ريبونوكلياز خالية من جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني) هو pipetted على لparafilm من غرفة الغسيل.
- باستخدام الملقط ، يتم وضعها الجانب coverslips الخلية يسقط على حل الضد الابتدائية ، وسمح لاحتضان في درجة حرارة الغرفة ل30min.
- لكل ساترة ، وpipetted قطرتين 1ml من برنامج تلفزيوني على أن parafilm من غرفة الغسيل.
- لإزالة coverslips الضد من تلطيخ الحل ، هو pipetted 1ml من برنامج تلفزيوني بجوار ساترة. وينبغي أن يوجه السائل تحت كل عينة من عمل شعري.
- باستخدام ملقط ، تتم إزالة coverslips ويوضع على كل قطرة الأولى من برنامج تلفزيوني عن 5min ثم وضعت على الهبوط الثانية من برنامج تلفزيوني لمدة 5min.
- وتتكرر الخطوات ل3.4.2 3.4.6 باستخدام الفلورية حل الضد الثانوية (1.0μg/ml الأضداد ، 0.1 ٪ TX - 100 ، في برنامج تلفزيوني 0.1mg/ml BSA). علما أنه منذ علامة حقن الحمض النووي الريبي ومرئية في قناة خضراء وحمراء ، والأجسام المضادة الثانوية يجب أن يكون مترافق لصبغة متوافق مثل Alexa647.
- هي التي شنت عليه في Coverslips 3.3.7.
4. التصوير والكمي
- التصوير
- ويستخدم مجهر epifluorescence لصورة الخلايا التالية الحقن. ويمكن وضع الخلايا حقن عن طريق تحديد موقع عبر الجروح وتحديد الخلايا التي تحتوي على علامة حقن (OG - ديكستران).
- لاحظ كل خلية ، ويتم الحصول على صورة من ديكستران OG - حقن. عند التصوير microinjected مرنا من المهم أن يقتصر تقدير إلى الخلايا التي تلقت> 90 ٪ من حقن السائل (أي ديكستران) في النواة.
- ثم يتم الحصول على صورة من الحمض النووي الريبي. السماح لقياس دقيقة من الحمض النووي الريبي ، وينبغي في الوقت التعرض بين جميع الخلايا ضمن دورة زمنية معينة لا تزال مستمرة وتدخل ضمن النطاق الديناميكي للكاميرا. من الناحية المثالية يجب أن تشمل كل صورة خلية uninjected لتكون قادرة على حساب الخلفية المناسبة مضان الأسواق العالمية ضغطهاnsity (انظر 4.2.4).
- للمساعدة في القياس الكمي ، ويمكن أيضا صورة من وصمة عار دابي سيتم شراؤها. أيضا إذا تم تنفيذ المناعي ، ويمكن أيضا أن البروتين يمكن تصوير الملون. ويرد مثال على توزيع مرنا في نقاط مختلفة في دورة الزمن في الشكل 4. ومرنا يشفر بروتين يفرز ، وبالتالي استهداف لائحة في الخلايا COS - 7. لاحظ أن تم التحقق من لائحة الاستهداف التي شاركت في تلطيخ الحمض النووي الريبي مع أجسام مضادة ضد TRAPα ، وهو بروتين ER المقيمين 11.
- الكمي
ويمكن تحقيق ذلك مع عدد من مختلف حزم البرمجيات تحليل الصور. ImageJ البرنامج هو مناسبة تماما لقياس توزيع الخلوية منذ مرنا يمكن استخدامه لفصل يدويا الكسور النووية وحشوية ، فإنه يمكن قياس متوسط مضان هذه الكسور ، ويمكن نسخ البيانات انتاجها بسهولة ولصق البرامج الأخرى ، مثل مايكروسوفت إكسل.- يتم فتح الصور المطابقة للأسماك ، OG دكستران ، ومضان دابي ودمج الصور باستخدام أداة لالمكدس.
- في دابي إما أو طبقة ديكستران يستخدم أداة عتبة لعزل المنطقة المقابلة لنواة microinjected. يتم تحديد هذه النسبة باستخدام أداة العصا ، وبعد انتقاله إلى طبقة الأسماك ، ومنطقة (A مجلس التوحيد الوطنى) وتعني / متوسط الكثافة (F مجلس التوحيد الوطنى) يتم تسجيلها باستخدام أداة القياس.
- ويرد في محيط الخلية باستخدام أداة اختيار حر ، وبينما على طبقة FISH تسجل منطقة (A توت) وتعني / متوسط الكثافة (F توت) باستخدام أداة القياس. إذا كان لديك مضان الخلية بشكل ملحوظ أكثر كثافة من تلك التي في الخلفية ، يمكنك استخدام أداة عتبة بدلا من أداة اختيار حر لمخطط الخلية التي تريدها.
- باستخدام وظيفة اختيار مستطيلة ، يتم رسم مربع على خلية uninjected وكثافة يعني / متوسط (F العودة) يتم تسجيلها.
- يتم نسخ جميع القياسات إلى ورقة عمل إكسل.
- ويتم احتساب مرنا تصديرها باستخدام المعادلة التالية :
A مجلس التوحيد الوطنى منطقة النواة وتوت منطقة خلية كاملة F مجلس التوحيد الوطنى متوسط مضان من الكسر النووية F توت متوسط مضان من جزء الخلية بأكملها F العودة متوسط مضان من خلية untransfected
من أجل كل نقطة زمنية يتم احتساب الصادرات ٪ في المتوسط وتآمر على مر الزمن. - ويتم احتساب الاستقرار مرنا بواسطة المتهم بالتآمر في متوسط إجمالي مضان مرنا (أ س توت (F توت -- F العودة)) مع مرور الوقت. عادة ما نجد أن كمية مرنا اختلافا كبيرا بين الخلايا وبين coverslips. هذا قد يكون راجعا إلى عدم الاتساق بين معدلات تدفق إبر وبين كفاءة تلطيخ الأسماك.
الشكل 1. تزرع ساترة Microinjection. خلايا حتى أنهم متموجة 70-90 ٪ ثم أصيب رأسيا وأفقيا باستخدام ماصة بلاستيكية 200μl الحافة. بدءا من الجرح المتبادل ، يتم حقن الخلايا على طول حافة الجرح واحد (السهم).
الشكل 2. المنظم الحقنة. أ) رسم تخطيطي للتدفق إظهار كيف يتم تجميعها المنظم المحاقن. ب) رسم تخطيطي للجهاز تجميعها. ج) صورة فوتوغرافية للمنظم حقنة تجميعها.
الشكل 3. آثار α - أمانيتين على نسخ من الحمض النووي البلازميد حقن الخلايا الليفية NIH3T3 ، والتي كانت ما قبل المعالجة بدرجات تركيزتم حقن من ليالي α - أمانيتين ، مع المنطقة الحرة برأس - T - DNA البلازميد وΔi OG - مترافق ديكستران 70kD. وحضنت حقن الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم الثابتة والملون ل- T - المنطقة الحرة برأس Δi مرنا باستخدام FISH probe6 محددة. كل صف يناظر حقل واحد من عرض لتصوير OG - 70kDa ديكستران ومرنا - T - المنطقة الحرة برأس Δi. علما أن ارتفاع ، ولكن ليس منخفضا ، وتركيزات من المخدرات منعت تماما إنتاج المنطقة الحرة برأس - T - Δi نص. مقياس شريط = 15μm.
الشكل 4. دوام التصدير مرنا النووية. تم حقن الخلايا COS - 7 مع المنطقة الحرة برأس - T - DNA البلازميد وΔi OG - مترافق ديكستران 70kD. وعولج 30min حقن الخلايا التالية مع α - أمانيتين والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة النقاط الزمنية المشار إليها. ثم تم إصلاح الخلايا وملطخة التحقيق ضد المنطقة الحرة برأس - T - Δi ومرنا مع الأجسام المضادة ضد TRAPα علامة ER. كل صف يناظر حقل واحد من الخلايا. أ) توزيع مرنا عقب timecourse microinjection. B) ونسف من نقطة زمنية 120min من (A) مما يدل على المشاركة في توطين المنطقة الحرة برأس - T - Δi مرنا وإيه. يظهر تراكب من مرنا - T - المنطقة الحرة برأس Δi (الأخضر) ، وتلطيخ TRAPα (الحمراء) في اللوحة اليمنى. أشرطة مقياس = 15μm.
Discussion
Microinjection هو أداة قوية يمكن استخدامها لدراسة عدد من العمليات الخلوية المختلفة. خلافا ترنسفكأيشن الخلية التقليدية ، microinjection يسمح للباحث أن أعرض على نحو فعال الأحماض النووية في نوى الخلايا خلال فترة زمنية ضيقة جدا. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن إجراء تحليلات الحركية مثل تحديد أسعار التصدير مرنا والتطويع اللغوي مرنا ، وتخليق البروتين. وعلاوة على ذلك ، لأن الإطار الزمني لهذه التجربة هي قصيرة نسبيا ، يمكن للمرء أن يعرض الخلايا إلى مركبات سامة داخل فترات زمنية قصيرة دون تكبد آثار عديد المظاهر. وعلاوة على ذلك ، يمكن المثبطة أو تنشيطية المركبات مثل البروتينات السلبية السائدة ، وشارك في حقن مع الأحماض النووية. أخيرا ، تجنب microinjections شرط الكواشف ترنسفكأيشن ، التي غالبا ما تكون سامة للخلايا ، ويمكن التشويش على الخليوي وظائف مختلفة.
مرنا مقابل حقن الحمض النووي البلازميد
اختيار منها الحمض النووي لحقن سيعتمد على عدد من الاعتبارات. التالية البلازميد حقن الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي الثاني بوليميريز ليس فقط يجمع مرنا ، ولكن أيضا من العوامل المجندين البروتين لنص 12،13 الوليدة. منذ هذه العوامل تحكم الأحداث مثل تجهيز مرنا ، تصدير المواد النووية والتوطين حشوية ، يمكن استخدام حقن الحمض النووي البلازميد لتقييم كيف يقترن النسخ لعمليات المصب. وإن كان من الممكن أن يقترن النسخ لتصدير المواد النووية 14 ، وجدنا أن يتم تصدير مرنا حقن أسرع قليلا مما كان عليه في كتب مرنا فيفو 6. أسباب ذلك ليست واضحة في الوقت الراهن ، ولكن هذه النتيجة قد تشير إلى أن مرنا كما مركبة جديدة تنبثق من الحمض النووي الريبي البلمرة الثاني ، قد تكون مرتبطة أنه حتى في المجمعات التي تؤخر تصدير المواد النووية.
هناك بعض المزايا مع حقن مرنا. أولا ، لا يملك الباحث في استخدام مثبطات البلمرة الجيش الملكي النيبالي ، والتي قد تؤثر على كيفية خلايا تنظيم عملية التمثيل الغذائي عموما من الحمض النووي الريبي. ثانيا ، يمكن تعديل الحمض النووي الريبي في المختبر قبل الحقن. على سبيل المثال ، يمكن توليفها مع مختلف mRNAs نظائرها سقف 5 'أو بولي (A) أطوال الذيل من أجل تقييم كيف تؤثر هذه الميزات تصدير المواد النووية 6. ثالثا ، يمكن أن يكون المبلغ المحدد من الحمض النووي الريبي الذي يتم حقنه يقدر تقريبا. بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، فإننا نقدر أن يتم حقن حوالي 20،000 إلى 50،000 في كل جزيئات النواة ، التي هي صغيرة نسبيا بالمقارنة مع العدد الكلي للمخطوطات في خلية الثدييات نموذجي (400،000 إلى 850،000 الجزيئات) 15. أما العيب الرئيسي مرنا مع الحقن هو أنه خلال microinjection ، تسرب بعض السوائل الحقن في السيتوبلازم أمر لا مفر منه. منذ مرنا حقنه مباشرة في السيتوبلازم غير مستقرة على مدى فترات طويلة (ألف قصر ، والمراقبة غير منشورة) ، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة لتحديد الخلايا التي كميا. عموما نحن نحلل الخلايا التي تلقت> 90 ٪ من السوائل الحقن في النواة ، وفقا لتقييم توزيع OG - ديكستران.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر غوميز E. للحصول على المشورة المفيدة وايلد ألف لسماحه لنا باستخدام معدات مختلفة. وأيد هذا العمل من خلال منحة لوكالة فرانس برس من المعهد الكندي للبحوث الصحية (سندات السعر العائم 102725).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection buffer | Sigma-Aldrich | 140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4 | |
| Oregon Green 488-70kD Dextran | Invitrogen | D7173 | Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80°C |
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Gel loading pipette tips for loading injection needles | Eppendorf | 022351656 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-S | |
| Micromanipulator | Narishige International | NT-88-V3MSH | |
| Syringe for injection | BD Biosciences | 512311 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
| SSC Buffer | Sigma-Aldrich | 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4 | |
| 4% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS |
| 0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28314 | Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS |
| Formamide | Fisher Scientific | F84-1 | |
| Dextran sulfate | Fisher Scientific | BP1585-100 | |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | |
| Vanadyl riboside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | R3380 | |
| Whatman filter paper | VWR international | 28298-020 | |
| Vibration control table | Kinetic Systems | 5702E-3036-21 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| α-amanitin | Sigma-Aldrich | A2263 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 695400008 | |
| T7 RNA Polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Poly(A) Polymerase | Ambion | AM1350 | |
| Hybridization Buffer | Sigma-Aldrich | 100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide |
References
- Luo, M. J., Reed, R. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).
- Bossie, M. A., Silver, P. A. Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).
- Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans. Genes Dev. 22, 66-78 (2008).
- Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).
- Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).
- Palazzo, A. F. The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA. PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).
- Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).
- Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science. 303, 836-839 (2004).
- Keller, H. E. Proper alignment of the microscope. Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).
- Mathews, D. H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).
- Görlich, D. The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents. J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).
- Perales, R., Bentley, D. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).
- Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Carter, M. G. Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, 61-61 (2005).
