Summary
Hier beschrijven we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescerende werken
Abstract
In eukaryoten, is messenger RNA (mRNA) getranscribeerd in de kern en moet worden geëxporteerd naar het cytoplasma naar de vertaling toegang machines. Hoewel de nucleaire export van mRNA is uitgebreid bestudeerd in Xenopus oöcyten 1 en genetisch handelbaar organismen zoals gist 2 en de Drosophila afgeleid S2 cellijn 3, hadden weinig studies zijn uitgevoerd in zoogdiercellen. Verder is de kinetiek van mRNA export in somatische cellen van zoogdieren kan alleen worden afgeleid indirect 4,5. Met het oog op de nucleaire export kinetiek van mRNA in zoogdieren weefselkweek cellen te meten, hebben we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescente in situ hybridisatie (FISH) in dienst heeft. Deze testen zijn gebruikt om aan te tonen dat in zoogdiercellen, het merendeel van de mRNA's worden uitgevoerd in een splicing afhankelijke manier 6,7, of op een wijze die specifieke RNA-sequenties, zoals de signaalsequentie coderende gebied (SSCR) 6 vereist. In deze test worden cellen gemicroinjecteerd met ofwel in vitro gesynthetiseerd mRNA of plasmide DNA dat het gen van belang. De gemicroinjecteerd cellen worden geïncubeerd gedurende verschillende tijdstippen dan de vaste en de sub-cellulaire lokalisatie van RNA wordt beoordeeld op basis FISH. In tegenstelling tot transfectie, waar transcriptie enkele uren ontstaat na de toevoeging van nucleïnezuren, micro-injectie van DNA of mRNA zorgt voor een snelle expressie en zorgt voor het genereren van nauwkeurige kinetische gegevens.
Protocol
Er zijn twee micro-injectie-gebaseerde methoden die kunnen worden gebruikt om de kinetiek van mRNA export meten in cellen van zoogdieren, injectie van in vitro gesynthetiseerde mRNA, of plasmide DNA, die wordt getranscribeerd in vivo in het mRNA. Elke techniek heeft zijn voordelen en nadelen. Hier beschrijven we beide technieken en bespreken de verschillen tussen de twee benaderingen.
1. De voorbereiding van materialen voor injectie
- In vitro getranscribeerde mRNA
- mRNA wordt getranscribeerd van beide plasmiden of PCR-producten die het gen van belang stroomopwaarts geflankeerd door de juiste RNA polymerase promotor (dwz T7 SP6 of initiatiefnemers) bevatten. Transcriptie is uitgevoerd in vitro met de juiste enzym (T7 of SP6 RNA polymerase, Invitrogen) met de juiste nucleotiden en overtollige cap analoog.
- Transcripten zijn gepolyadenyleerde in vitro met behulp van poly-A-polymerase (Invitrogen) en ATP volgens de fabrikant van de protocollen.
- Het mRNA wordt vervolgens gezuiverd met behulp van kolommen van zowel Invitrogen of Qiagen.
- Geëlueerd mRNA wordt vervolgens neergeslagen door het toevoegen van 1/20ste volume 3M kaliumacetaat en twee volumes van 100% ethanol bij -20 ° C gedurende een uur gevolgd door centrifugatie bij 13.000 g bij 4 ° C gedurende 30min. Als er teveel vloeistof aanwezig is, kan de pellet wordt gewassen met ijskoude 70% ethanol.
- De resulterende mRNA pellet wordt de lucht gedroogd en vervolgens opgelost in injectie buffer (140mm en 10mm HEPES KCl, pH 7,4). Merk op dat eventuele verontreiniging ethanol giftig kunnen zijn voor de gemicroinjecteerd cel. De opgeloste mRNA kan worden gehouden bij -80 ° C voor opslag op lange termijn.
- Voor de micro-injectie, is het mRNA verdund tot 200μg/ml in injectie buffer en gemengd met Oregon Green 488 (OG)-geconjugeerde 70kDa dextran (1mg/ml, Invitrogen). Sinds de OG-geconjugeerde dextran is te groot om te diffunderen in de nucleaire porie, zal het in staat stellen een niet alleen te ingespoten cellen te identificeren, maar ook helpen om te bepalen hoeveel van de vloeistof werd geïnjecteerd in de kern en hoeveel gelekt in het cytoplasma ( zie 4.1.2). Als alternatief kan elke tl-licht, hoog moleculair gewicht molecuul dat in staat is de nucleaire porie traverse worden gebruikt.
- Monsters worden gecentrifugeerd bij 13.000 g bij 4 ° C gedurende tenminste 20 minuten vóór het laden van de naald om pellet alle fijn stof die potentieel kan belemmeren de naald.
- Plasmide DNA
- Plasmide DNA met het gen van belang kan worden bereid met behulp van standaard DNA-zuivering kits van Qiagen. Over het algemeen groter DNA-preparaten zijn vaak van hogere kwaliteit en dus efficiënter worden getranscribeerd na de injectie.
- Plasmide DNA wordt verdund 50 tot 200μg/ml in injectie buffer met OG-geconjugeerde 70 kDa dextran (1mg/ml).
- Voorafgaand aan het laden van de naald, is de injectie vloeistof gecentrifugeerd bij 13.000 g bij 4 ° C gedurende ten minste 20 minuten.
- Naalden voor micro-injectie
- Naalden zijn vervaardigd uit 1,0 mm borosilicaatglas capillaire buisjes (post # 1B100F-3; Wereld Precision Instruments Inc) met behulp van een Sutter P97 Flaming / Bruin Micropipet Puller met een 2,5 mm filament.
- De injectie naalden zijn gegenereerd met behulp van een drie stappen te trekken programma met behulp van een 2.5x4.5 mm doos gloeidraad (item # FB245B, Sutter Instrument Co). Het programma parameters gebruikt in dit experiment zijn hieronder opgesomd, maar ze moet worden geoptimaliseerd voor elke gloeidraad.
Stap # Warmte Trek Snelheid Tijd Druk 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500
(Ramp temperatuur = 740)
- Celpreparaat
- In het algemeen alle zoogdieren cellijn kan worden gemicroinjecteerd echter celtypen die goed verspreid zijn over het algemeen meer vatbaar voor injectie. De keuze van de cellijn kan ook afhangen van andere factoren. Bijvoorbeeld, mRNA's die coderen voor uitgescheiden eiwitten zijn gericht op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum en dit is veel meer zichtbaar in COS-7 cellen in vergelijking met NIH 3T3 fibroblasten 6 (vergelijk de lokalisatie van t-FTZ-Δi mRNA in cijfers 3 en 4).
- De cellen moeten worden ingedeeld op zuur gewassen vierkante dekglaasjes (25x25mm) in 30mm petridishes voor minstens 24 uur voorafgaand aan de micro-injectie. In sommige cellijnen kan verspreiden worden gestimuleerd door uitplating cellen op fibronectine gecoate dekglaasjes 6,8. Idealiter zou de cellulaire monolaag moet ongeveer 70-90% confluent worden op het moment van injectie.
- Te zorgen voor een gemakkelijke identificatie van de geïnjecteerde cellen, is de cel monolaag voorafgaand aan de injectie gewond door het gebruik van een 200μl plastic pipet tip. Over het algemeen een kruis wond (figuur 1) is geëtst op het dekglaasje en de cellen worden overgelaten om te herstellen voor minstens 15 minuten voorafgaand aan de injectie in de weefselkweek incubator.
- Tijdens de micro-injectie, weefselcultuurmedia verliest langzaam CO 2 om de verspreiding en als gevolg daarvan wordt alkali. Om te helpen handhaven van een neutrale pH-waarde tijdens de injectie, kunnen de media worden aangevuld met 10 mM HEPES pH 7,4. De extra buffer kan worden toegevoegd aan de media de dag voor micro-injectie.
- De microscoop en micromanipulator
- Cellen worden gemicroinjecteerd met behulp van een omgekeerde microscoop dat is geïsoleerd op een lucht-tafel aan trillingen die kunnen ook afbreuk doen aan de micro-injectie te minimaliseren. De microscoop is uitgerust met twee doelstellingen, een droge 10x stuk, dat wordt gebruikt om de cellen en de naald, en een droge 40x extra lange werkafstand fase doelstelling, die wordt gebruikt om het imago van de micro-injectie proces.
- Optische aberraties veroorzaakt door het bekijken van cellen over het dekglaasje en de petrischaal kunnen worden opgeheven indien het doel heeft een correctie kraag. Ervoor zorgen dat de microscoop helderveld goed is uitgelijnd voor Köhler verlichting 9, zal ook de juiste hulp voor aberraties als gevolg van het licht verstrooid door de injectienaald (zie 2.2.4).
- De naald wordt gecontroleerd door een drie-assige opknoping joystick micromanipulatie apparaat (NT-88-V3MSH, Narishige). De grove manipulator is bevestigd aan de achterkant pijler van de microscoop, zodat de naald gemakkelijk omhoog en omlaag in de schaal met behoud van haar oorspronkelijke positie.
- De naald is bevestigd aan een wand die is vastgeklemd aan de grove manipulator. Een buis verbindt de wand met een 5cc glazen injectiespuit (Item # 512311; Becton Dickinson), die de inspuitdruk die nodig zijn om vocht te verwijderen uit de punt van de micro-injectie naald genereert. Om de controle van de druk niveau worden de spuit en de zuiger zijn plaats gehouden door een spuit regulator, die bestaat uit twee stoppers, een buisklem (verkrijgbaar bij elke bouwmarkt) en twee metalen beugels (figuur 2). Om ervoor te zorgen dat de spuit onder hoge druk, vacuüm vet (Dow Corning) houdt wordt toegepast op de zuiger.
- De TL-hybridisatieprobe
- De primaire sequentie van de geïnjecteerde nucleïnezuur wordt gevouwen met behulp van RNA secundaire structuur voorspelling software, zoals RNAstructure 4.6 10.
- Het mRNA plooien zijn visueel beoordeeld om een gebied van ongeveer 50 nucleotiden die de neiging heeft om vrij te zijn van secundaire structuren met een hoog smeltpunt temperaturen, zoals lange dubbele strengen te identificeren.
- Het omgekeerde complement van deze regio is gesynthetiseerd met een Alexa546 fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de sonde (deze kunnen gekocht worden bij Integrated DNA Technologies).
- De sonde wordt met water verdund tot een concentratie van 100 urn en wordt opgeslagen bij -80 ° C gedurende 2-3 jaar.
2. Intranucleaire micro-injectie
- Het laden van de injectievloeistof op de micro-injectie microscoop
- Ongeveer 1μl van de injectievloeistof is getrokken uit de gecentrifugeerd DNA of mRNA monster met behulp vanGELoader tips (Item # 022351656; Epindorff). Vloeistof moet worden weggezogen uit de top van het monster te voorkomen dat de korrel, die fijn stof dat de naald kunnen verstoppen bevat.
- De tip van de pipet wordt ingebracht in de back-end van de naald en de vloeistof wordt uitgeworpen. Vloeistof worden gevestigd op de naald door capillaire werking en een meniscus in de buurt van de top moet zichtbaar zijn binnen de 5-30sec.
- De met vloeistof gevulde naald wordt ingevoegd in de staf, die vervolgens wordt aan de micromanipulator geklemd in een hoek van 45 °.
- De naald is gevisualiseerd met het 10x objectief en is gepositioneerd in het centrum van het bekijken van het vliegtuig in de buurt van het brandvlak met behulp van de grove micromanipulator knoppen. De naald wordt dan verhoogd een paar millimeter om te voorkomen dat deze beschadigd in latere stappen (2.2.2) en vervolgens de microscoop rug pijler is teruggedrongen.
- De druk wordt verhoogd door indrukken van de zuiger 0,5-2cc.
- Micro-injectie
- Een petrischaal met een cover-slip met een gewonde monolaag wordt geplaatst op de weergave podium.
- De microscoop terug pijler is naar voren getrokken om een rechtopstaande positie, waardoor de condensor op elkaar worden afgestemd en de naald om de vloeistof in te voeren. Dit moet zorgvuldig gebeuren om te voorkomen dat de naald uit te breken op het dekglaasje (zie 2.1.4).
- Met behulp van de 10x doel, is het centrum van het kruis wond geïdentificeerd en de naald is gepositioneerd boven de cellen te injecteren.
- De vergroting wordt verhoogd door te schakelen naar de 40x objectief en de naald is verlaagd en gecentreerd met de fijnregeling op de joystick. Als het beeld onscherp is, moet men ervoor zorgen dat het invallende licht goed is uitgelijnd (dat wil zeggen Kölher verlichting 9) met behulp van een Bertrand lens (zie 1.5.2).
- Injectie zou moeten beginnen in een hoek van de wond kruis en verder langs een rand voor gemakkelijke identificatie van de geïnjecteerde cellen tijdens de visualisatie (zie figuur 1).
- De naald wordt verlaagd om contact te maken met de kern. Men kan nu reeds zeggen dat een cel is geïnjecteerd door de opmerkelijke verandering in de fase van helderheid die injectie begeleidt.
- Als de vloeistof vult de hele cel het kan erop wijzen dat de druk te hoog is en dient te worden verlaagd.
- Als er geen verandering in de fase van de helderheid wordt gedetecteerd, kan dit betekenen dat ofwel de micro-injectie druk niet sterk genoeg is om doorboren de celmembraan, of dat de naald verstopt is. Onvoldoende druk, onvolmaaktheden in de naald, en de verstopping van de naald met kleine deeltjes: dit kan het gevolg zijn van een aantal kwesties, waaronder zijn. Omdat het laden van elke naald in de micromanipulator is tijdrovend, en omdat de injectie substraat is vaak zeer waardevol, is het belangrijk om te maximaliseren van het percentage van de naalden die effectief kan worden gebruikt voor injecties. Hieronder is een stap-voor-stap handleiding voor het proberen om een verstopte naald te deblokkeren. Na elke stap moet men proberen om 2-3cells injecteren om te beoordelen of obstructie is verwijderd:
Actie Doel en Doel 1 Stel focus op de lengte van de naald te bekijken. Om te bepalen of er sprake is een duidelijke tekortkoming in de naald of dat er een groot stuk van deeltjes het blokkeren van de tip. 2 Plaats de naald naast een zwevend stukje van deeltjes in de schaal. Indien er vloeistof is het verlaten van de tip moet schudden het deeltje zonder dat het komt direct in contact met de naald. 3 Druk de zuiger tot het einde van de spuit Deze tijdelijke verhoging van de druk moet duidelijk een obstakel aan het uiteinde. Na het loslaten van de zuiger, moet het stijgen op uit eigen beweging, zo niet, betekent dit dat de druk niet wordt opgebouwd in de spuit en je moet de verbindingen en / of extra draai vacuüm vet toe te voegen. 4 Zet de naald uit de cel media De kracht van het trekken van de naald uit de waterige media kunnen helpen verjagen obstructies bij de punt van de naald. 5 Volledig verwijderen van de zuiger van de spuit en plaats deze opnieuw. Deze extra stijging van de druk kan nodig zijn om de punt van de naald duidelijk. 6 Kras de naald op een schone deel van het dekglaasje Deze verdere ageert de deeltjes in de naald en helpt herpositioneren om de obstructie op het uiteinde te verlichten. Sterkere krabben kan chip af aan het einde van de tip, waardoor de belemmering van de naald af te sluiten. 7 Plaats een nieuwe naald
Een ander veelvoorkomend probleem is het geleidelijke verlies van druk in de naald, die regelmatig schadevergoeding door een verdere indrukken van de zuiger in de spuit. Vaak kan het toevoegen van extra vacuüm vet aan op de zuiger helpen handhaven meer consistente druk. Maar dit probleem kan te wijten zijn aan lekken van de verbindingen tussen spuit en buis, de buis en de wand, of de staf en de naald. De meeste lucht lekken kunnen worden verzegeld met behulp van Parafilm (Fisher) of vet indien nodig, hoewel lekken tussen de staf en de naald kan alleen worden verholpen door het veranderen van de rubberen afdichting in de staf. - Cellen langs een wondrand zijn gemicroinjecteerd langs de wondrand voor een vaste periode van tijd (10-15min). Met de praktijk enkele honderden cellen kunnen worden geïnjecteerd tijdens dit interval.
- Na de micro-injectie worden de cellen geïncubeerd bij 37 ° C in een weefselkweek incubator voor de gewenste hoeveelheid tijd voorafgaand aan de fixatie. Als het injecteren van DNA, wordt transcriptie beëindigd na 20 minuten door het behandelen van cellen met α-amanitin (1μg/ml, Sigma-Aldrich) opgelost in de groei media. Deze concentratie remt effectief transcriptie van gemicroinjecteerd plasmide (figuur 3).
- Een enkele naald kan worden hergebruikt voor meerdere dekglaasjes injecteren, hoewel de naald moet worden vervangen wanneer een wijziging van het type DNA of RNA dat is gemicroinjecteerd. Zodra de naald is verwijderd uit de staf is dient te worden vernietigd en niet opnieuw gebruikt worden.
- Dode of drijvende cellen af en toe vasthouden aan de naald en kunnen interfereren met micro-injectie. Om dit te vuil te verwijderen van de naald, opent u de naald uit de vloeistof door het verleggen van de pilaar en dan langzaam de naald weer opnieuw in de vloeistof door bijstelling van de pilaar naar de verticale positie.
- Voor het verkrijgen van een nauwkeurige meting van de mRNA nucleaire export kinetiek meting, moeten afzonderlijke monsters te worden vastgesteld op 0min, 15min, 30min, 60min en 120min post-RNA micro-injectie, of na α-amanitin behandeling.
3. Cel fixatie en kleuring
- Cel fixatie en permeabilisatie
- Op het juiste moment, is de groei media afgezogen en de cellen worden tweemaal gewassen met 2 ml PBS-oplossing (137mm NaCl, 2.7mm KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7,4). Het is belangrijk om de dekglaasjes vochtig door het minimaliseren van de tijd dat ze niet worden ondergedompeld in vloeistof.
- Worden de cellen gefixeerd door toevoeging van 2 ml van 4% paraformaldehyde (Electron Microscope Wetenschappen) in PBS gedurende minstens 15 minuten bij kamertemperatuur.
- De vaste monsters worden tweemaal gewassen met PBS-oplossing.
- De cellen zijn gepermeabiliseerd met 2 ml van 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende minstens 15 minuten bij kamertemperatuur.
- De monsters worden tweemaal gewassen met PBS-oplossing.
- FISH kleuring
- Naast de monsters moeten worden voorbereid voor hybridisatie. De cellen worden tweemaal gewassen met 1 x SSC-oplossing (NaCl 150mm, 15mm natriumcitraat, pH 7,0) met 25-60% formimide. Voor het bedrag van formamide, maken gebruik van dezelfde concentratie die aanwezig is in de hybridisatie-oplossing (zie 3.2.3).
- Ter voorbereiding op de kleuring kamer, is de bodem van een petrischaal 150mm bedekt met water en een stuk Parafilm is dreef op het water. Het water wordt verwijderd door het draaien van de schotel over, waardoor de Parafilm te houden aan de bodem van de schaal. Luchtbellen worden handmatig opnieuwverplaatst.
- Voor elke dekglaasje te worden gemerkt, 100μl druppels van de hybridisatie-oplossing (25-60% formamide, 100mg/ml dextraansulfaat, 1mg/ml E. coli tRNA, 5mM Vanadyl riboside complex in 1x SSC met de sonde verdund 1:500) worden gepipetteerd op de Parafilm. Merk op dat de hoeveelheid van formamide moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke FISH probe wordt gebruikt.
- Met de hulp van pincet, is een dekglaasje verwijderd uit een 30mm petrischaal, vervolgens met behulp van Whatman filter papier (VWR) de achterzijde (cel-vrije zijde) van het dekglaasje wordt gedroogd en overtollige buffer is slecht vanaf de voorkant zonder het drogen van de vaste cellen. Het dekglaasje wordt dan geplaatst naar beneden op de FISH-oplossing. Dit wordt herhaald voor elk dekglaasje aan.
- Na het plaatsen van de kleuring kamer deksel weer op, worden de monsters geïncubeerd voor 5-18u bij 37 ° C.
- Wassen en Montage van de Stained Samples
- Verschillende wassen kamers worden gemaakt op dezelfde wijze als de vlekken kamer (zie 3.2.2).
- Voor elke dekglaasje, is 1 ml wasbuffer (1x SCC met 25-60% formamide) gepipetteerd op de parafilm van de waskamer. Nogmaals, gebruik van dezelfde concentratie van formamide die aanwezig is in de hybridisatie-oplossing (zie 3.2.3).
- Voor het verwijderen van de dekglaasjes van de vlekken kamer, 1 ml wasbuffer is naast het dekglaasje gepipetteerd. De vloeistof moet worden opgesteld onder elk monster door capillaire werking.
- Met behulp van een tang, zijn de dekglaasjes verwijderd en elk is geplaatst op de daling van de wasbuffer en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Stappen 3.3.2 tot en met 3.3.4 zijn twee keer meer herhaald, zodat elke dekglaasje is een totaal drie keer gewassen.
- Als het RNA wordt costained met een aantal eiwitten door immunofluorescentie, zie paragraaf 3.4.
- Dia's worden gewassen met 70% ethanol en gedroogd met Kimwipes. Voor elke dekglaasje, is 10 tot 30 pl van montage oplossing met DAPI (Fluoromount G, Zuid-Biotech) gepipetteerd op de dia's. Elke dia is geschikt voor twee dekglaasjes.
- Met behulp van een tang en Whatman filter papier, de achterkant van de dekglaasjes is gedroogd en overtollige vloeistof is slecht uit de voorkant van het dekglaasje, zonder het drogen van de monsters. Elke dekglaasje wordt vervolgens naar beneden geplaatst, op de daling van montage oplossing.
- Gemonteerde samples kan opslaan bij 4 ° C.
- Immunofluorescentiekleuring
- De monsters moeten twee keer worden gewassen met PBS om formamide, die kunnen interfereren met de juiste antilichaam vlekken te verwijderen.
- Voor elke dekglaasje, 50μl van primaire antilichaam-oplossing (1.0μg/ml antilichaam, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml RNAse-vrij BSA in PBS) is gepipetteerd op de parafilm van een waskamer.
- Met behulp van een tang, zijn dekglaasjes geplaatst cel naar beneden op de primaire antilichaam oplossing en mocht bij kamertemperatuur incuberen voor 30min.
- Voor elke dekglaasje worden twee druppels 1 ml PBS gepipetteerd op de parafilm van een waskamer.
- Voor het verwijderen van de dekglaasjes van het antilichaam kleuroplossing, is 1 ml PBS naast het dekglaasje gepipetteerd. De vloeistof moet worden opgesteld onder elk monster door capillaire werking.
- Met behulp van een tang, zijn de dekglaasjes verwijderd en elk is geplaatst op de eerste druppel PBS voor 5min en vervolgens geplaatst op de tweede druppel PBS voor een ander 5min.
- Stappen 3.4.2 tot 3.4.6 worden herhaald met de tl-secundaire antilichaam-oplossing (1.0μg/ml antilichaam, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA in PBS). Merk op dat sinds de injectie marker en RNA zijn zichtbaar in de groene en rode kanaal, het secundaire antilichaam moet worden geconjugeerd aan een compatibele kleurstof, zoals Alexa647.
- Coverslips worden gemonteerd als in 3.3.7.
4. Imaging en kwantificering
- Imaging
- Een epifluorescentiemicroscoop wordt gebruikt om het imago van de cellen na de injectie. Geïnjecteerde cellen kan worden gevonden door het plaatsen van het kruis wonden en het identificeren van cellen met geïnjecteerd marker (OG-dextran).
- Voor elke cel waargenomen, wordt een beeld van de geïnjecteerde OG-dextran verworven. Bij de beeldvorming mRNA gemicroinjecteerd is het belangrijk dat kwantificering is beperkt tot cellen die> 90% van de geïnjecteerde vloeistof (dat wil zeggen dextran) ontvangen in de kern.
- Een afbeelding van het RNA wordt dan overgenomen. Te zorgen voor de nauwkeurige meting van RNA, moet de belichtingstijd tussen alle cellen binnen een bepaald tijdsverloop constant en vallen blijven binnen het dynamische bereik van de camera. Idealiter elk beeld moet een uninjected cel te kunnen berekenen van de juiste achtergrond fluorescentie intensity (zie 4.2.4).
- Als hulp bij het kwantificeren, kan een beeld van de DAPI vlek ook worden verkregen. Ook als immunofluorescentie werd uitgevoerd, kan de gekleurde eiwit ook worden afgebeeld. Een voorbeeld van mRNA distributie op verschillende punten in een tijdsverloop is weergegeven in Figuur 4. Het mRNA codeert voor een uitgescheiden eiwit en is dus gericht op de ER in COS-7 cellen. Merk op dat de ER-targeting werd geverifieerd door co-kleuren van de RNA met antilichamen tegen TRAPα, een inwoner ER proteïne 11.
- Kwantificatie
Dit kan worden bereikt met een aantal van de verschillende beelden analyse software pakketten. ImageJ software is zeer geschikt voor het kwantificeren van cellulaire mRNA distributie, omdat het kan worden gebruikt om handmatig scheiden nucleaire en cytoplasmatische fracties, kan het meten van de gemiddelde fluorescentie van deze fracties, en de output gegevens kunnen gemakkelijk worden gekopieerd en geplakt in andere software, zoals Microsoft Excel.- Foto's die overeenkomen met FISH, OG-dextran, en DAPI fluorescentie worden geopend en samengevoegd met behulp van de beelden naar gereedschap Stack.
- In zowel de DAPI of dextran laag de drempel tool wordt gebruikt om het gebied dat overeenkomt met de gemicroinjecteerd kern te isoleren. Deze fractie is gekozen via de Wand tool, en na de verhuizing naar de FISH laag, het gebied (A NUC) en het gemiddelde / gemiddelde intensiteit (F Nuc) worden opgenomen met het gereedschap Meetlat.
- De cel perimeter wordt uiteengezet met behulp van de Freehand selectie-instrument, en terwijl op de FISH laag het gebied (A Tot) en het gemiddelde / gemiddelde intensiteit (F Tot) worden opgenomen met het gereedschap Meetlat. Als uw cel fluorescentie is aanzienlijk intensiever dan die van de achtergrond, kunt u gebruik maken van de Threshold tool in plaats van de Freehand selectie tool om uw gewenste cel te schetsen.
- Met behulp van de rechthoekige selectie-functie, is een box getrokken over een uninjected cel en de gemiddelde / gemiddelde intensiteit (F Back) is opgenomen.
- Alle metingen worden gekopieerd naar een Excel-werkblad.
- Geëxporteerde mRNA wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
Een Nuc Gebied van de kern A Tot Gebied van de hele cel F Nuc Gemiddelde fluorescentie van de nucleaire fractie F Tot Gemiddelde fluorescentie van de hele cel fractie F Terug Gemiddelde fluorescentie van een ongetransfecteerde cel
Voor elk tijdstip het gemiddelde% Export is berekend en uitgezet in de tijd. - mRNA stabiliteit wordt berekend door het plotten van de gemiddelde totale mRNA fluorescentie (A Tot x (F Tot - F Back)) in de tijd. Normaal gesproken vinden we dat bedrag van mRNA sterk varieert tussen de cellen en tussen de dekglaasjes. Dit kan te wijten zijn aan gebrek aan samenhang tussen de naald debieten en tussen de efficiëntie van de FISH vlekken.
Figuur 1. Micro-injectie dekglaasje aan. Cellen worden gekweekt tot ze 70-90% confluent vervolgens verticaal en horizontaal verwond met een plastic pipet 200μl tip. Uitgaande van de cross-wond, worden de cellen geïnjecteerd langs een wondrand (pijl).
Figuur 2. Spuit regulator. A) Flow diagram te laten zien hoe de spuit regelaar is gemonteerd. B) Schematische voorstelling van de verzamelde apparaat. C) Een foto van de verzamelde spuit regulator.
Figuur 3. Effecten van α-amanitin op de transcriptie van geïnjecteerde plasmide DNA. NIH3T3 fibroblast-cellen, die werden voorbehandeld met verschillende concentratiess van α-amanitin, werden geïnjecteerd met t-FTZ-Δi plasmide DNA en OG-geconjugeerde 70kD dextran. Geïnjecteerde cellen werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 1 uur en daarna gefixeerd en gekleurd voor T-FTZ-Δi mRNA met behulp van een specifieke FISH probe6. Elke rij komt overeen met een enkele gezichtsveld afgebeeld voor de OG-70kDa dextran en t-FTZ-Δi mRNA. Merk op dat een hoge, maar niet laag, de concentratie van het geneesmiddel volledig geremd productie van t-FTZ-Δi transcript. Schaalbalk = 15μm.
Figuur 4. Tijdsverloop van mRNA nucleaire export. COS-7 cellen werden geïnjecteerd met t-FTZ-Δi plasmide DNA en OG-geconjugeerde 70kD dextran. 30min na de injectie cellen werden behandeld met α-amanitin en geïncubeerd bij 37 ° C voor de aangegeven tijdstippen. De cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met probe tegen de t-FTZ-Δi mRNA en met antilichamen tegen de ER marker TRAPα. Elke rij komt overeen met een enkel veld van cellen. A) mRNA distributie na een micro-injectie tijdsverloop. B) Een klap van de 120min tijdstip van (A) het aantonen van de co-lokalisatie van t-FTZ-Δi mRNA en de ER. Een overlay van de t-FTZ-Δi mRNA (groen) en TRAPα (rood) kleuring is weergegeven in het rechter paneel. Schaal bars = 15μm.
Discussion
Micro-injectie is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om een aantal verschillende cellulaire processen te bestuderen. In tegenstelling tot conventionele celtransfectie, micro-injectie kan de onderzoeker om effectief nucleïnezuren te introduceren in de cellulaire kernen binnen een zeer korte periode aan. Als gevolg daarvan kan men uitvoeren kinetische analyses zoals het bepalen van de tarieven van mRNA export, mRNA lokalisatie en de eiwitsynthese. Aangezien de looptijd van het experiment is relatief kort, kan men blootstellen cellen toxische stoffen binnen korte tijd overspanning zonder dat pleiotrope effecten. Bovendien kan remmende of stimulerende verbindingen zoals dominant negatief eiwitten, worden co-geïnjecteerd met de nucleïnezuren. Tot slot, micro-injecties voorkomen dat de eis voor transfectiereagentia, die vaak giftig voor cellen en kunnen verstoren verschillende cellulaire functies.
mRNA vs plasmide DNA injecties
De keuze van de nucleïnezuur te injecteren zal afhangen van een aantal overwegingen. Naar aanleiding van plasmide DNA injectie, RNA polymerase II niet alleen synthetiseert mRNA, maar ook rekruten eiwit factoren om de ontluikende transcript 12,13. Aangezien deze factoren bepalen evenementen zoals mRNA verwerking, de nucleaire export-en cytoplasmatische lokalisatie, kan plasmide DNA injecties worden gebruikt om te beoordelen hoe transcriptie is gekoppeld aan downstream-processen. Hoewel de transcriptie kan worden gekoppeld aan de nucleaire export 14, hebben we gemerkt dat ingespoten mRNA is iets sneller dan in vivo getranscribeerd mRNA 6 geëxporteerd. De redenen hiervoor zijn niet duidelijk op dit moment, maar dit resultaat kan erop wijzen dat als nieuw gesynthetiseerde mRNA blijkt uit RNA polymerase II, kan het vast in complexen die vertragen de nucleaire export.
Er zijn een aantal voordelen met mRNA injecties. Ten eerste heeft de onderzoeker niet te RNA polymerase-remmers gebruiken, dat kan invloed hebben op hoe de cellen van het totale metabolisme van RNA te reguleren. Ten tweede kan het RNA worden gewijzigd in vitro voorafgaand aan de injectie. Zo kan mRNA's worden gesynthetiseerd met verschillende 5 'cap-analogen of poly (A) staart lengte om te kunnen beoordelen hoe deze functies nucleaire export 6 beïnvloeden. Ten derde kan het exacte bedrag van RNA die wordt ingespoten ruwweg worden geschat. Naar aanleiding van het protocol hierboven omschreven, we schatten dat ongeveer 20.000 tot 50.000 moleculen worden geïnjecteerd in elke kernen, dat is relatief klein in vergelijking met het totaal aantal transcripten in een typische zoogdiercellen (400.000 tot 850.000 moleculen) 15. Het grote nadeel van mRNA injecties is dat tijdens micro-injectie, een aantal lekken van injectievloeistof in het cytoplasma onvermijdelijk is. Sinds mRNA direct geïnjecteerd in het cytoplasma is stabiel over lange periodes (A. Palazzo, ongepubliceerde waarnemingen), moet extra zorg worden genomen om te selecteren welke cellen worden gekwantificeerd. Over het algemeen analyseren we cellen die> 90% van de injectievloeistof ontvangen in de kern, zoals beoordeeld door de verdeling van OG-dextran.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag E. Gomes bedanken voor nuttige adviezen en A. Wilde voor het toestaan van ons om diverse apparatuur te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan AFP van het Canadese Institute for Health Research (FRN 102.725).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection buffer | Sigma-Aldrich | 140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4 | |
| Oregon Green 488-70kD Dextran | Invitrogen | D7173 | Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80°C |
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Gel loading pipette tips for loading injection needles | Eppendorf | 022351656 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-S | |
| Micromanipulator | Narishige International | NT-88-V3MSH | |
| Syringe for injection | BD Biosciences | 512311 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
| SSC Buffer | Sigma-Aldrich | 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4 | |
| 4% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS |
| 0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28314 | Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS |
| Formamide | Fisher Scientific | F84-1 | |
| Dextran sulfate | Fisher Scientific | BP1585-100 | |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | |
| Vanadyl riboside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | R3380 | |
| Whatman filter paper | VWR international | 28298-020 | |
| Vibration control table | Kinetic Systems | 5702E-3036-21 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| α-amanitin | Sigma-Aldrich | A2263 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 695400008 | |
| T7 RNA Polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Poly(A) Polymerase | Ambion | AM1350 | |
| Hybridization Buffer | Sigma-Aldrich | 100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide |
References
- Luo, M. J., Reed, R. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).
- Bossie, M. A., Silver, P. A. Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).
- Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans. Genes Dev. 22, 66-78 (2008).
- Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).
- Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).
- Palazzo, A. F. The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA. PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).
- Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).
- Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science. 303, 836-839 (2004).
- Keller, H. E. Proper alignment of the microscope. Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).
- Mathews, D. H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).
- Görlich, D. The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents. J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).
- Perales, R., Bentley, D. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).
- Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Carter, M. G. Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, 61-61 (2005).
