Summary
Uitgelijnd electrospun vezels direct de groei van neuronen in vitro en zijn een potentieel onderdeel van de zenuw regeneratie steigers. We beschrijven een procedure voor het bereiden van electrospun vezels substraten en de serum-vrije cultuur van primaire rat E15 sensorische (DRG) en de motor neuronen. Visualisatie van de neuronen door middel van immunocytochemie is ook inbegrepen.
Abstract
Electrospinning is een techniek voor de productie van micro-naar nano-schaal vezels. Vezels kunnen worden electrospun met verschillende gradaties van afstemming, van zeer afgestemd op volledig willekeurig. Daarnaast kunnen vezels worden gesponnen uit een verscheidenheid van materialen, waaronder biologisch afbreekbare polymeren, zoals poly-L-melkzuur (PLLA). Deze eigenschappen maken electrospun vezels geschikt voor een verscheidenheid aan toepassingen in de steigers tissue engineering. Onze focus ligt op het gebruik van de lijn electrospun vezels voor zenuw regeneratie. We hebben eerder al aangetoond dat afgestemd electrospun PLLA vezels de uitgroei van zowel de primaire sensorische en motorische neuronen in vitro direct. Wij onderhouden dat het gebruik van een primaire celkweek systeem essentieel is bij het evalueren van biomaterialen om model echte neuronen gevonden in vivo zo dicht mogelijk. We beschrijven hier technieken die gebruikt worden in ons laboratorium te vezelig steigers en cultuur achterwortelganglia explantaten, evenals gedissocieerd sensorische en motorische neuronen, op electrospun steigers electrospin. Echter, de electrospinning en / of cultuur hier gepresenteerde technieken makkelijk aangepast voor gebruik in andere toepassingen.
Protocol
1. Poly-L-melkzuur (PLLA) spinoplossing
- Los 0,4 g PLLA in 9 ml chloroform door roeren op een laag vuur.
- Voeg 1 mL dimethylformamide aan de oplossing, waardoor de uiteindelijke concentratie van de oplossing tot 4% PLLA (w / v) in chloroform: DMF 09:01 (v / v).
- Plaats de oplossing in een polypropyleen of glazen injectiespuit met een stompe 23ga metalen tip.
2. Spinning Voorbereiding van de ondergrond een
- Maak een 8% (w / v) oplossing van 85:15 PLGA (poly-melkzuur-co-glycolzuur) in chloroform door te roeren op een laag vuur.
- Vacht schoon glas dekglaasjes in PLGA door het bedekken van het oppervlak van elke dekglas met de PLGA oplossing. Laat de PLGA om te drogen op een dunne film (ca. 30 min).
3. Electrospinning 2
- Secure PLGA gecoat glas dekglaasjes naar de collector met geleidende carbon tape. Voor uitgelijnd vezels, de collector is een motor aangedreven wiel. Voor willekeurige vezels, de collector is een stationaire plaat.
- Plaats spuit in de pomp met de tip 20 cm van de collector wiel. Zet de pomp tot ongeveer 2 ml / uur en bij gebruik van een wiel, zet de motor tot 300-400 RPM. Indien mogelijk, toe te passen een -2 kV DC bias naar de collector en +15 kV op metalen tip. Bij het ontbreken van toegang tot een bipolaire voeding, grond de verzamelaar.
- Vezels straal van de spuit en verzamel op de draaiende wiel. Blijven draaien totdat de gewenste dichtheid van de vezels wordt verkregen. Swipe de metalen tip met een papieren handdoek aangebracht op een niet-geleidende staaf regelmatig om verstopping te voorkomen aan het uiteinde.
4. Moating een
- Na de spinnen, 'gracht' van de electrospun monsters door pipetteren een lijn van PLGA rond de perimeter van het dekglas. Laat de PLGA om te drogen. Dit houdt de uitlijning van de vezels tijdens de cultuur.
5. Eiwit Coating
- Electrospun vezels en glas controles moeten worden gecoat in eiwit voorafgaand aan de celcultuur. Bedek de substraten in een proteïne-oplossing voor ten minste een uur en dan aspireren overtollige oplossing en ga aanzuigen totdat de ondergrond droog zijn. Mogelijke eiwit oplossingen omvatten: PLL (poly-L-lysine) (100 ug / ml), laminine (25 ug / ml) of met fibronectine (50 ug / ml). Als PLL wordt gebruikt, moet substraten worden gespoeld in steriel water en gedroogd twee keer na de eerste coating.
6. Verkrijgen E15 Rat embryo's 3
* Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Gids voor Zorg en gebruik van proefdieren, zoals goedgekeurd door de Universiteit van Michigan Comite voor gebruik en verzorging van dieren.
- Voorbereiding: Controleer of het dier zwanger is. Dooi 3 ml trypsine, 3 ml FBS en warm een fles L15. Brand polish een Pasteur pipet. Desinfecteer alle chirurgische instrumenten in 70% ethanol gedurende 30 minuten.
- Voor te bereiden en warm plating media (zie tabel 1).
- Euthanasie: Voer een IP-injectie van ketamine / xylazine. Wacht 10-15 minuten en controleer of het ontbreken van het hoornvlies en pedaal terugtrekking reflexen. Zodra reflexen zijn afwezig, voert een IC injectie van pentobarbital (FatalPlus).
- Tent de huid van de buik. Gesneden door de huid en de spieren lagen om de buikholte bloot te leggen. Ga naar de baarmoeder en los het op de baarmoederhals en eierstokken.
- Verwijder het embryo uit de baarmoeder met een schaar en onmiddellijk plaats ze in warm L15. (Al de volgende procedures zijn afgerond onder een dissectiemicroscoop en embryo's en ontleed snoeren moeten worden ondergedompeld in een warm L15 ten alle tijden.) Onthoofden van de embryo's door het sluiten van een tang rond de kin en onder de occipitale bot van de schedel.
7. Dissection 3
- Plaats de embryo aan een kant. Bescherm het ruggenmerg met een set van de tang tijdens het gebruik van de andere set weg te halen ledematen en buikorganen.
- Draai het embryo en houd hem vast met een set van de tang. Snip langs de lengte van het embryo, vanaf de nek tot de staart, totdat het hele koord wordt blootgesteld.
- Pak het uiteinde van het snoer en trek het over zichzelf naar de staart te verwijderen. Het koord trekt gratis met membraan en achterwortelganglia (DRG) bijgevoegd.
- Als DRG explant of losgekoppeld sensorische neuron cultuur moet worden uitgevoerd, knip de DRG uit het snoer en overbrengen naar een nieuw gerecht van warm L15.
- Voor de DRG explantatie cultuur, gaat u naar 10,2 stap
- Voor de gescheiden sensorische neuron cultuur, ga dan naar stap 9
- Voor motorneuron cultuur, zal de DRG worden verwijderd met het membraan in stap 7.5
- Verwijder het membraan van het ruggenmerg door het vast te pakken aan de bovenkant van het snoer en de peeling het naar beneden, vergelijkbaar met het verwijderen van een lange sok. Herhaal dit voor alle embryo's en dan hak de touwen in kleine (2-3 mm) stukken.
- Giet de gehakte snoeren en L15 in een conische en de spin bij 1000 rpm gedurende 2-3 min om pellet de stukken.
- Giet het supernatant en voeg 3 ml van trypsine aan het ingehulde koorden. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 20 minuten.
- Voeg 3 ml FBS om conische en spin bij 1000 rpm gedurende 2-3 minuten opnieuw pellet.
- Giet het supernatant en de vacht van een brand gepolijst Pasteur pipet met FBS.
- Voeg een Pasteur pipet vol met L15 de conische en dan zachtjes vermaal totdat de oplossing homogeen is zonder zichtbare bosjes. Te vermijden bubbels.
- Bereid een 9% oplossing van Optiprep in L15. Bereid een buisje met 3 ml van de Optiprep oplossing voor elke twee embryo's (als er een oneven aantal embryo's, een stijging van rond).
- Laat de gehomogeniseerde oplossing op de Optiprep oplossing, het verdelen van het gelijkmatig onder alle buizen. Spin de buizen bij 2000 rpm gedurende 15 minuten.
- Zorgvuldig verzamelen top 2 ml van elk buisje en zwembad in een 50 mL conisch. Vul de conische met L15 en draaien op 1000 rpm gedurende 5 minuten aan de cellen van Optiprep spoelen.
- Giet het supernatant en resuspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid in de platen media (250-500 pi). Tel de cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting aan levende cellen te identificeren. Ga naar 10,1 stap
9. Sensory Neuron (SN) Verwerking 7
- Giet de DRG verwijderd uit het ruggenmerg en de L15 in een conische buis en draaien op 1000 RPM gedurende 2-3 min om pellet de stukken.
- Giet het supernatant en voeg 3 ml van trypsine aan het ingehulde DRG. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten.
- Voeg 3 ml FBS om conische en spin bij 1000 rpm gedurende 2-3 minuten opnieuw pellet.
- Giet het supernatant en de vacht van een brand gepolijst Pasteur pipet met FBS.
- Voeg een Pasteur pipet vol met L15 de conische en dan zachtjes vermaal totdat de oplossing homogeen is zonder zichtbare bosjes. Te vermijden bubbels.
- Spin de homogenaat bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Giet het supernatant en resuspendeer de cellen in een kleine hoeveelheid van SN plating media (250-500 pi). Tel de cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting aan levende cellen te identificeren. Doorgaan met 10,1 stap
10. Plating en Cultuur
- Voor gedissocieerd SN of MN cultuur:
- Bedek de ondergrond met een paar druppels van de media en voeg dan een geschikt volume van de celsuspensie. Gescheiden cellen moet worden uitgeplaat op een lage dichtheid (25-50 cellen / mm 2). Laat de cellen gedurende ten minste een uur houden voor overstromingen van de putten met de media.
- Voor de DRG explantatie cultuur:
- Bedek de ondergrond met een paar druppels van de media en voeg DRG aan de media. Schik de DRG, zodat ze gelijkmatig verdeeld over de ondergrond (ongeveer 4 DRG past op een 22x22 mm dekglas). Laat de DRG gedurende ten minste vier uur voordat u zich overstromingen van de putten met de media.
- Culturen kan worden gehandhaafd tot 4 dagen zonder media te veranderen. Voor langere culturen, moet half media veranderingen worden gedaan met diervoeder media. Feed media is het dezelfde samenstelling heeft als beplating media minus de L-glutamine.
11. Immunocytochemie 1,5,8
- Bevestiging cellen: Zuig media en te vervangen door warm 4% PFA (paraformaldehyde) gedurende 30 minuten. Vervolgens voert 3X 5 min 1x PBS wasbeurten.
- Blokkeren / permeabilisatie: Bereid block / perm-oplossing (1,25% bovine serum albumine in 1X PBS, 0,05% Triton X-100 en 2,0% gewone geit serum). Aspireren PBS en toe te passen blokkeren / permanenten oplossing om monsters gedurende 30 minuten. Vervolgens voert 1X 5 min 1x PBS wasbeurten.
- Primair antilichaam: Bereid primaire antilichaam werkende oplossing (10% normaal geit serum, 1,25% bovine serum albumine, 0,1% Na azide, 0,05% Triton X-100 en tot 10 ml met 1x PBS). Voeg de juiste hoeveelheid primaire antilichaam (zie tabel 2). Lijn een aantal gerechten met parafilm. Plaats een 200μl kraal van de primaire antistof oplossing op de parafilm voor elke ondergrond. Omkeren van de substraten, drijvende hen cel naar beneden op het primaire antilichaam werkende oplossing 's nachts (als de kamer is voorzien van airconditioning of bijzonder droog is, kan een stukje van het water verzadigd papier worden toegevoegd aan een hoek van de schotel om verdamping van de werkoplossing te voorkomen) .
- Secundair antilichaam: Verwijder de substraten van de primaire (de werkende oplossing kan worden verzameld, opgeslagen bij 4 ° C en hergebruikt) en het uitvoeren van 2X 5 min 1x PBS wasbeurten. Van toepassing zijn 200 ul secundair antilichaam verdund 1:200 in PBS (ook omgekeerd op parafilm gevoerd schotel) voor 4 uur.
- Te verwijderen uit het secundair Vervolgens voert 2X 5 min 1x PBS wasbeurten. Mount substraten op dia's met Verleng Gold met DAPI of een ander geschikt nucleaire tegen vlekken.
12. Representatieve resultaten:
De typische morfologie van lijn en willekeurige electrospun vezels zijn weergegeven in figuur 1. We meestal krijgen MN zuiverheid van> 90% neuronen 7,8 met dit protocol en we hebben onderhouden DRG culturen zo lang als een week zonder noemenswaardige fibroblast groei. Figuur 2 toont typische MN verschijning op glas en vezels na 24 uur van cultuur en immunokleuring. Immunostained DRG gekweekt voor drie dagen op glas en vezels zijn afgebeeld in figuur 3.
Figuur 1. Fiber uitlijning wordt gemanipuleerd door de keuze van verzamelaar. A.) gebonden vezels gesponnen op een draaiend wiel collector en B.) random vezels gesponnen op een stationaire plaat collector. Schaal bars = 20 urn.
Figuur 2. Representatieve motor neuronen gekleurd voor TuJ1 (groen) en DAPI (blauw) na 24 uur van cultuur op PLL gecoate A.) vezels en B.) glas. Schaal bars = 20 urn.
Figuur 3. Vertegenwoordiger DRG gekleurd voor neurofilament (groen) na 3 dagen van cultuur op PLL gecoat A.) glas en B.) vezels. Schaal bars = 200 micrometer.
| Stamoplossing: | MN media: | DRG / SN media: |
| 10 mg ml-1 albumine | 12,5 ul | - |
| 10 mg ml-1 apo-transferrine | 50 ui | 40 pi |
| 50 ug ml-1 β-estradiol | 2,7 pl | 2,2 pl |
| 0,1 mg ml-1 biotine | 50 ui | - |
| 16 mg ml-1 catalase | 8 ul | - |
| 15 mg ml-1 D-galactose | 50 ui | - |
| 50 ug ml-1 hydrocortisone | 3,7 pl | 2,9 pl |
| 0,63 mg ml-1 progesteron | 0,5 pl | - |
| 16 mg ml-1 putrescine | 50 ui | - |
| 50 ug ml-1 selenium | 3,4 pl | 4,1 pl |
| 2,5 mg ml-1 superoxide dismutase | 50 ui | - |
| * 500 ng ml-1 zenuwgroeifactor | - | 1 mL |
| * 100X PSN | 0,5 ml | 0,5 ml |
| * B27 | 1 mL | 1 mL |
| * 2 mM L-glutamine | 35 pl | 35 pl |
| * Neurobasal | tot 50 ml | tot 50 ml |
Tabel 1. Add speelde (*) componenten die de media vlak voor gebruik. De overige onderdelen kunnen worden bereid als een stockoplossing aanwezig zijn en bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is 6,7.
| Primaire (concentratie) | Neuronen: | Glia: | Fibroblasten: |
| anti-β-tubuline (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-neurofilament (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anti-NGFR p75 (1:500) | ✓ | ✓ | X |
Tabel 2. De selectie van primaire antilichaam is afhankelijk van de doelstellingen van de onderzoeker. De bovenstaande zijn verschillende antilichamen en de concentraties hebben we met succes gebruikt in ons laboratorium. S-100 is bijzonder nuttig om Schwann-cellen te signaleren en / of voor vervuilende fibroblasten te controleren, maar dat het moet worden gebruikt in combinatie met NGFR p75 onderscheid te maken tussen glia en fibroblasts4 noot. We hebben ook gemerkt dat NGFR p75 vlekken neurieten heel licht, terwijl neurofilament of TuJ1 zijn uitstekende keuzes als het doel is om te visualiseren individuele neurieten.
Discussion
Dit protocol heeft een aantal kritische stappen. De eerste betreft de goede productie van de vezel electrospun substraten. In vloeibare media, zal de PLLA vezels, PLGA film en PLGA gracht gescheiden van de glazen dekglas als een eenheid. Als de PLGA is weggelaten, zal de PLLA vezels niet blijven een vlakke plaat - ze zullen krullen in een kluwen onbruikbaar. Zo wordt de PLGA film opgenomen als een geschikt substraat naar glasvezel lijn te behouden tijdens de cultuur. De gracht wordt toegevoegd na het spinnen zowel om ervoor te zorgen dat de vezels stevig bevestigd aan de PLGA film en de structurele stijfheid toe te voegen aan de film. De gracht dient ook als een nuttig handvat wanneer de substraten worden gemanipuleerd tijdens de vaststelling van vlekken en montage. Fijnwrijving is de tweede belangrijke stap. Alles in het werk moet worden gedaan om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Daarnaast hebben wij veel hogere opbrengsten bij een brand-gepolijste pipet is gebruikt voor deze stap. Om brand polijsten, licht een bunsenbrander en voeg een gloeilamp aan het pipet. Snel voorbij de punt van de pipet door de vlam 2-3 keer onder voortdurend knijpen en loslaten van de bol - luchtstroom door de pipet zal helpen voorkomen dat de tip van het sluiten van volledig. Onderzoek de punt van de pipet om ervoor te zorgen het gat is nog steeds open en dat de randen verschijnen een beetje afgerond voor gebruik.
Electrospinning is een zeer veelzijdige proces; de electrospinning parameters kunnen worden aangepast aan vezels met een verscheidenheid van morfologieën te produceren. Tan et al.. (2005) bevat een systematische studie van de parameters die de diameter van PLLA electrospun vezels. Wang et al.. (2009) geeft een gedetailleerde studie van de parameters die de afstemming van electrospun PLLA vezels.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
