Summary
זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.
Abstract
בידוד והתרחבות של תאים המשוערת גזע עצביים (NSCs) מהמוח Murine מבוגר תוארה לראשונה בשנת 1992 על ידי ריינולדס וייס העסקת הגדרה כימית סרום ללא מערכת התרבות המכונה assay neurosphere (NSA). ב assay זה, רוב סוגי תאים מובחנים למות בתוך ימים ספורים של תרבות אלא אוכלוסייה קטנה של גורם הגדילה התאים מגיבים מבשר לעבור התפשטות פעיל בנוכחותו של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו / צמיחה בסיסי גורם fibroblastic (bFGF). תאים אלה יוצרים מושבות של תאים שלא עברו התמיינות בשם neurospheres, אשר בתורו יכול להיות subcultured כדי להרחיב את מאגר בתאי גזע עצביים. יתר על כן, התאים יכול להיגרם להבדיל, שהניבו את שלושת סוגי התאים העיקריים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית, כלומר האסטרוציטים, ו oligodendrocytes. Assay זה מספק כלי רב ערך כדי לספק מקור עקבי, מתחדשת של מבשרי CNS מובחן, אשר יכול לשמש עבור במבחנה וגם למטרות טיפוליות.
וידאו זה מדגים את שיטת NSA ליצור ולהרחיב NSCs מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור. ההליך כולל קצירת המוח של העכבר הבוגרת, מיקרו דיסקציה של האזור periventricular, הכנת הרקמה והתרבות של NSA. הרקמה שנקטפו הוא הראשון מתעכל כימית באמצעות טריפסין-EDTA ולאחר מכן ניתק מכני בינוני NSC להשיג ההשעיה תא יחיד מצופה לבסוף ב NSA. לאחר 7-10 ימים תרבות, neurospheres העיקרי הנובע מוכנים תת להגיע כמות התאים הנדרשת בניסויים עתידיים.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay neurosphere 2 צברה תשומת לב רחבה בקהילה המחקר לא רק בידוד המחקר של מערכת העצבים המרכזית NSCs מ 4-5, אלא גם עבור בידוד של סוגים אחרים של בתאי גזע המשוערת מרקמות רבות, כמו חזה ולב 6 ו 7 לצורך זיהוי של השד המוח, גידול במעי הגס בתאי גזע 8-9 טוען כי מערכת זו תרבות ניתן ליישם מספר גופניות הגידול תא מבשר אוכלוסיות בכל הגוף. חלק מן היתרונות של שיטה זו כוללים, בפשטותו reproducibility הדור של מספר בלתי מוגבל של תאים חתיכה קטנה של רקמה או אפילו מספר קטן של תאים בינוניים הגדרה כימית חופשית בסרום.
יודגש כי מספר neurospheres בתרבות אינו מייצג את מספר בתאי גזע כמו neurospheres ניתן לגזור גם מתוך בתום בתאי גזע בתום או יותר ובתאים מוגבלת 10. בהקשר זה assay פותחה כראוי למנות NSCs בתרבות 11.
שיטות שונות משמשות כדי לנתק neurospheres לתוך ההשעיה תא יחיד כולל שיטות מכאניות האנזימטית. אמנם שיטה מכנית היא neurosphere המקורי דיסוציאציה שיטה 2, זה דורש הרבה ניסיון ויעילות שלה משתנה בהתאם למפעיל. שיטה זו גם עלולה לגרום מוות של תאים נזק משמעותי אם להחיל על ידי אדם לא מנוסה, שיכול להקטין את הדיוק של מבחני המסתמכים על neurosphere דיסוציאציה 3. טריפסין-EDTA דיסוציאציה אנזימטית יש גם כמה יתרונות וחסרונות. דיסוציאציה אנזימתי של neurospheres קל, יעיל לשחזור אם ביצע לאורך המתאים של זמן על neurospheres בגודל הנכון. למרות שאין צד לצד מחקרים משווים את ההשפעה של שתי השיטות של neurosphere דיסוציאציה, הניסיון שלנו מראה כי דגירה קצר (3-5 דקות) של neurospheres (עד 250 מיקרומטר) עם טריפסין-EDTA תוצאות דיסוציאציה יעיל מבלי להפריע יכולות, הכדאיות שגשוג והתמיינות שלהם. מאידך, חשיפה ארוכה של neurospheres (במיוחד עבור neurospheres מגודל גדול) כדי טריפסין-EDTA עלול לגרום נזק חמור קולטנים פני התא, עיכול התא ומוות התא פוטנציאלי. חשיפת יתר טריפסין-EDTA עלול גם להפריע היווצרות כדור ותאי לגרום לצרף המצע להבדיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
