Summary
このビデオプロトコルは、成体マウスの脳室周囲領域からの神経幹細胞を生成し、拡大するニューロスアッセイ法を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。
Abstract
成体マウスの脳から推定神経幹細胞（NSC）の単離と拡大は、最初のニューロスアッセイ（NSA）と呼ばれる化学的に定義された無血清培養系を採用した1992年にレイノルズとワイスによって記述されていた。このアッセイでは、分化した細胞型の大部分は、文化の数日以内に死亡するが、成長因子応答性の前駆細胞の小集団は、上皮成長因子（EGF）および/基本的な線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で積極的増殖を受ける。これらの細胞は、順番に神経幹細胞のプールを拡大して継代培養することができるニューロスフェアと呼ばれる未分化細胞のコロニーを形成する。また、細胞はニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、すなわち中枢神経系の三大細胞型を生成し、分化を誘導することができます。このアッセイは、in vitro試験とまた治療目的のために使用される可能性未分化のCNS 前駆体、の一貫性のある、再生可能エネルギー源を供給する貴重なツールが用意されています。
このビデオでは、成体マウスの脳室周囲領域からのNSCを生成し、拡大するNSA方式を示し、一方は再現性のニューロスフェア培養を達成できるように技術的な洞察を提供しています。手順はNSAで、成体マウスから脳室周囲の領域、組織の準備と文化の顕微解剖を脳の収穫が含まれています。収穫された組織は、最初に化学的にトリプシン- EDTAを用いて消化し、単一の細胞懸濁液とNSAで最終的にメッキを達成するためにNSCの培地にして機械的に解離される。文化の中で7〜10日後、得られた主なニューロスフェアは、将来の実験のために必要な細胞数に到達するためのサブカルチャーのための準備が整いました。
Protocol
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Discussion
ニューロスフェアのアッセイ2は、乳癌6、心臓7として、単離および多数の組織から推定される幹細胞の他のタイプの分離4-5でなく、中枢神経系からのNSCの研究のためだけでなく、研究コミュニティで広く注目を集めていると脳、乳房および結腸腫瘍幹細胞の培養系が体細胞と体全体に腫瘍前駆細胞集団の数に適用できることを示唆して8-9の識別のため。この方法の利点のいくつかは、その単純さ、再現性、さらには小さな組織片または化学的に定義された無血清培地中の細胞の数が少ないから、細胞の不特定多数の世代を含む。
それは、ニューロスフェアは、10善意の幹細胞からまたはより制限された前駆細胞のいずれかから派生させることができるように文化のニューロスフェアの数が幹細胞の数を表していないことが強調されるべきである。この点でのアッセイは、正しく文化11のNSCのを列挙するために開発されました。
別の方法は機械的および酵素的方法を含む、単一の細胞懸濁液にニューロスフェアを解離するために使用されます。機械的な方法は、オリジナルのニューロスフェア解離法2ですが、それは多くの経験を必要とし、その効率は演算子によって異なります。ニューロスフェア解離3に依存するアッセイの精度を低下させることができる経験のない個々の、によって適用される場合、このメソッドはまた、重要な細胞死と損傷を与える可能性があります。トリプシン- EDTA酵素的解離はまた、いくつかの長所と短所があります。時間の適切な長さのために、右側サイズのニューロスフェアで実行した場合、ニューロスフェアの酵素的解離は、簡単で効率的かつ再現可能です。ニューロスフェア解離のこれら二つの手法の効果を比較する側の研究では副作用はありませんが、我々の経験は示してその効率的な解離のトリプシン- EDTAの結果とニューロスフェアの短いインキュベーション（3-5分）（最大250ミクロン）その生存、増殖および分化能力を邪魔することなく。一方、トリプシン- EDTAにニューロスフェアの長時間露光は、（特に大規模な草に覆われたニューロスフェアのための）細胞表面の受容体、細胞の消化と潜在的に細胞死に重大な損傷を引き起こす可能性があります。トリプシン- EDTAへの過剰暴露はまた、基板に取り付けると区別するために、球の形成と原因細胞を妨害する可能性があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
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- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
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