Summary
Это видео демонстрирует протокол neurosphere метод анализа для создания и расширения нервные стволовые клетки из взрослых региона перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere.
Abstract
Выделение и расширение предполагаемого нервные стволовые клетки (NSCs) от взрослых мышиных мозга была впервые описана Рейнольдса и Вайс в 1992 году использовании определенного химического бессывороточной культуре системы, известной как neurosphere анализа (NSA). В данном анализе большинства дифференцированных типов клеток умирают в течение нескольких дней культуры, но небольшая популяция реагирует фактор роста клеток-предшественников подвергаются активной пролиферации в присутствии эпидермального фактора роста (ЭФР) и / основной фактор роста фибробластов (bFGF). Эти клетки образуют колонии недифференцированных клеток, называемых нейросферы, который, в свою очередь, может быть субкультивировали расширить пул нервные стволовые клетки. Более того, клетки могут вызвать их дифференцировку, создавая трех основных типов клеток центральной нервной системы, т.е. нейроны, астроциты и олигодендроциты. Этот препарат обеспечивает бесценным инструментом для питания последовательными, возобновляемый источник недифференцированных предшественников ЦНС, которые могут быть использованы для экстракорпорального исследований, а также в лечебных целях.
Это видео демонстрирует метод АНБ для создания и расширения NSCs от взрослого регионе перивентрикулярной мыши, и предоставляет технические идеи для обеспечения можно добиться воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка мозг от взрослой мыши, микро-рассечение перивентрикулярной области, подготовки ткани и культуры в АНБ. Собрано ткани первой химически переваривается использованием трипсина-EDTA и затем механически диссоциированных в среде НСК для достижения суспензии отдельных клеток и, наконец, помещают в АНБ. Через 7-10 дней в культуре, в результате первичного нейросферы готовы к субкультуре достичь количества клеток, необходимых для будущих экспериментов.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurosphere анализа 2 получила широкое внимание в научное сообщество не только для выделения и изучения NSCs из ЦНС 4-5, но и для выделения других типов предполагаемых стволовых клеток из различных тканей, таких как рак молочной железы 6 и 7 и сердце для идентификации мозга, молочной железы и толстой кишки опухолью стволовые клетки 8-9 предполагая, что эта культура система может быть применена к ряду соматических и опухолевых предшественников клеточных популяций по всему телу. Некоторые из преимуществ этого метода является его простота, воспроизводимость и генерации неопределенного числа клеток с небольшой кусочек ткани или даже небольшое число клеток в химически определенной среде без сыворотки.
Следует подчеркнуть, что число нейросферы в культуре не представляет количество стволовых клеток в качестве нейросферы могут быть получены либо из добросовестных стволовых клеток или из более ограниченного клеток-предшественников 10. В этой связи анализ был разработан правильно перечислить NSCs в культуре 11.
Различные методы используются, чтобы отделить нейросферы в суспензии отдельных клеток, включая механические и ферментативные методы. Хотя механический метод является оригинальным neurosphere диссоциации метод 2, она требует большого опыта и его эффективность зависит от оператора. Этот метод также может нанести значительный клеточной гибели и повреждения при нанесении неопытного человека, который может уменьшить точность анализов, которые полагаются на neurosphere диссоциации 3. Трипсин-EDTA ферментативной диссоциации также имеет некоторые преимущества и недостатки. Ферментативной диссоциации нейросферы легко, эффективный и воспроизводимый, если оно проводится для соответствующего периода времени, а справа размером нейросферы. Хотя Есть не рядом исследований, сравнивающих эффекты этих двух методов neurosphere диссоциации, наш опыт показывает, что краткие инкубации (3-5 мин) из нейросферы (до 250 мкм) с трипсин-ЭДТА приводит к эффективной диссоциации без нарушения их жизнеспособности, пролиферации и дифференцировки возможностей. С другой стороны, длинные выдержки из нейросферы (особенно для больших заросших нейросферы) для трипсина-EDTA может привести к серьезному повреждению поверхности клеточных рецепторов, клеточных пищеварения и, возможно, гибели клеток. Длительное воздействие трипсина-EDTA может также вмешиваться в формирование сферы и вызвать клеткам прикрепляться к субстрату и дифференцировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
