Summary
Denna video protokoll visar neurosphere analys metod för att generera och utöka neurala stamceller från vuxna möss periventrikulär regionen, och tillhandahåller teknisk insikt för att man kan uppnå reproducerbara neurosphere kulturer.
Abstract
Isolering och expansion av den förmodade neurala stamceller (NSCs) från den vuxna murina hjärnan beskrevs först av Reynolds och Weiss år 1992 anställa ett kemiskt definierat serumfritt kultur systemet kallas neurosphere analys (NSA). I denna analys, de flesta av differentierade celltyper dör inom ett par dagar av kultur, men en liten population av en lyhörd tillväxtfaktor föregångare celler genomgå aktiv spridning i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och / grundläggande fibroblastic tillväxtfaktor (bFGF). Dessa celler bildar kolonier av odifferentierade celler som kallas neurospheres, som i sin tur kan subkultiveras att utöka den pool av neurala stamceller. Dessutom kan celler fås att differentiera, genererar de tre stora celltyper i CNS, dvs nervceller, astrocyter och oligodendrocyter. Denna analys ger ett ovärderligt verktyg för att tillhandahålla ett konsekvent, förnybar odifferentierade CNS-prekursorer, som kan användas för in vitro-studier och även i terapeutiska syften.
Denna video visar hur NSA metod för att generera och utöka NSCs från vuxna möss periventrikulär regionen, och tillhandahåller teknisk insikt för att man kan uppnå reproducerbara neurosphere kulturer. Förfarandet omfattar skörd hjärnan från vuxna möss, mikro-dissekering av periventrikulär regionen vävnad förberedelse och kultur i NSA. Den skördade vävnaden är först kemiskt upplösas med trypsin-EDTA och sedan mekaniskt dissocierade i NSC mediet för att nå en enda cell fjädring och slutligen klädd i NSA. Efter 7-10 dagar i kultur, den resulterande primära neurospheres är redo för subkultur att nå mängd celler som behövs för framtida experiment.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den neurosphere analys 2 har fått bred uppmärksamhet i forskarvärlden, inte bara för isoleringen och studiet av NSCs från CNS 4-5, men också för isolering av andra typer av förmodade stamceller från många vävnader, såsom bröst-6 och hjärta 7 och för identifiering av hjärnan, bröst-och tjocktarmscancer tumör stamceller 8-9 tyder på att denna kultur systemet kan tillämpas på ett antal somatiska och tumör föregångare populationer cell i hela kroppen. Några av fördelarna med denna metod är bland annat dess enkelhet, reproducerbarhet och generering av obestämt antal celler från en liten bit vävnad eller ens ett litet antal celler i ett kemiskt definierade serum fritt medium.
Det bör understrykas att antalet neurospheres i kultur inte representerar antalet stamceller som neurospheres kan härledas antingen från seriösa stamceller eller från mer begränsade progenitorceller 10. I detta avseende ett test har utvecklats för att korrekt räkna NSCs i kultur 11.
Olika metoder används för att särskilja neurospheres till en enda cellsuspension inklusive mekaniska och enzymatiska metoder. Även mekaniska metod är den ursprungliga neurosphere dissociation metod 2, kräver det en hel del erfarenhet och dess effektivitet varierar beroende på operatör. Denna metod kan också orsaka betydande celldöd och skador om tillämpas av en oerfaren individ, vilket kan minska noggrannheten i analyser som bygger på neurosphere dissociation 3. Trypsin-EDTA enzymatiska dissociation har också några fördelar och nackdelar. Enzymatisk dissociation av neurospheres är enkelt, effektivt och reproducerbar, om de utförs under lämplig tid och på rätt storlek neurospheres. Även om det finns någon sida vid sida studier som jämför effekterna av dessa två metoder för neurosphere dissociation, visar vår erfarenhet att en kort inkubationstid (3-5 min) av neurospheres (upp till 250 mikrometer) med trypsin-EDTA resulterar i en effektiv dissociation utan att störa deras livskraft, tillväxt och differentiering kapacitet. Å andra sidan kan långa exponering av neurospheres (särskilt för stora övervuxna neurospheres) till trypsin-EDTA orsaka allvarliga skador på cellens yta receptorer, cell matsmältningen och potentiellt celldöd. Överexponering av trypsin-EDTA kan också störa sfären bildning och celler anledning att fästa till underlaget och differentiera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
