Summary
Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.
Abstract
Yetişkin fare beyin varsayılan sinir kök hücrelerinin (NSC'lerde) izolasyonu ve genişleme ilk neurosphere assay (NSA) olarak bilinen kimyasal olarak tanımlanmış serum serbest kültür sistemi istihdam Reynolds ve Weiss tarafından 1992 yılında tarif edilmiştir. Bu testte, farklılaşmış hücre tiplerinin çoğunluğu kültür birkaç gün içinde ölürler ama küçük bir nüfus büyüme faktörü duyarlı öncü hücreler aktif proliferasyonu epidermal büyüme faktörü (EGF) ve / temel fibroblastik büyüme faktörü (bFGF) varlığında tabi. Bu hücreler nöral kök hücre havuzu genişletmek için pasajlandı olabilir neurospheres adlı farklılaşmamış hücreler, koloniler oluşturur. Ayrıca, hücrelerin, merkezi sinir sistemi, yani nöronlar, astrositler ve oligodendrosit üç ana hücre tipleri üreten ayırt etmek için uyarılan olabilir. Bu testte, in vitro çalışmalar ve aynı zamanda tedavi amaçlı kullanılan olabilir farklılaşmamış MSS öncüleri, tutarlı bir, yenilenebilir kaynak sağlamak için paha biçilmez bir araç sağlar .
Bu video NSC'lerde yetişkin fare periventriküler bölge oluşturmak ve genişletmek için NSA yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar. Bu prosedür, NSA yetişkin fare, periventriküler bölgede mikro diseksiyon, doku hazırlanması ve kültür beyin hasat içerir. Hasat doku ilk kez tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve nihayet NSA kaplama kimyasal MGK orta tripsin-EDTA ve daha sonra mekanik olarak ayrışmış kullanılarak sindirilir. Kültür 7-10 gün sonra ortaya çıkan birincil neurospheres altkültürün gelecek deneyler için gerekli olan hücrelerin miktarı ulaşmak için hazırız.
Protocol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurosphere tahlil 2 MSS 4-5 izolasyon ve NSC'lerde çalışma için değil, aynı zamanda meme 6 ve 7 kalp gibi birçok dokulardan varsayılan kök hücrelerin, diğer türlerinin izolasyonu için sadece araştırma topluluğu geniş dikkat çekti. beyin, meme ve kolon tümör kök hücreler bu kültür sistemi, somatik ve vücutta tümör habercisi hücre popülasyonlarının bir dizi uygulanabilir olduğunu düşündüren 8-9 belirlenmesi için . Bu yöntemin bazı avantajları basitlik, tekrarlanabilirlik ve belirsiz sayıda küçük bir parça doku veya hücrelerin kimyasal olarak tanımlanmış serum serbest orta hatta küçük bir sayı hücreleri nesil içerir.
Bu neurospheres bona fide kök hücreleri veya daha kısıtlı progenitör hücrelerin 10 ya elde edilebilir kültür neurospheres sayısı, kök hücrelerin sayısını temsil etmez vurguladı olmalıdır . Bu bağlamda kültür 11 doğru NSC'lerde numaralandırmak için bir test geliştirildi.
Mekanik ve enzimatik yöntemler de dahil olmak üzere tek bir hücre süspansiyonu içine neurospheres ayırmak farklı yöntemler kullanılmaktadır. Orijinal neurosphere disosiasyon yöntem 2 mekanik yöntem olmasına rağmen, bir çok deneyim gerektirir ve verimliliği operatöre göre değişir. Neurosphere disosiasyon 3 güveniyor testlerinin doğruluğunu azaltabilir deneyimsiz bir kişi tarafından uygulandığı takdirde, bu yöntem aynı zamanda önemli bir hücre ölümü ve zarar görmesine neden olabilir. Tripsin-EDTA enzimatik disosiasyon de bazı avantajları ve dezavantajları vardır. Zaman uygun uzunlukta ve doğru ölçekli neurospheres eğer neurospheres Enzimatik disosiasyon, kolay, etkin ve tekrarlanabilir. Neurosphere disosiasyon bu iki yöntemden etkilerini karşılaştıran hiçbir yan yan çalışmaları ile olmasına rağmen, deneyimlerimiz gösteriyor ki, verimli bir disosiasyon tripsin-EDTA sonuçları neurospheres kısa bir inkübasyon (3-5 dakika) (250 mikron kadar) canlılığı, proliferasyon ve farklılaşma yetenekleri bozmadan. Öte yandan, tripsin-EDTA neurospheres uzun pozlama (özellikle büyük büyümüş neurospheres), hücre yüzey reseptörleri, hücre sindirim ve potansiyel olarak hücre ölümüne ciddi şekilde zarar görmesine neden olabilir. Tripsin-EDTA kalmanın da yüzey eklemek ve ayırt kürenin oluşumu ve neden hücreleri etkileyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Overstreet Vakfı parasal destek verdi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. New tissue dissociation protocol for scaled-up production of neural stem cells in suspension bioreactors. Tissue Eng. 10, 904-913 (2004).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Dontu, G. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).
- Messina, E. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Ignatova, T. N. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 39, 193-206 (2002).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
