ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.
Abstract
Karaciğer, 1 hayatta kalmak için besin ve oksijen ve atıkların uzaklaştırılması teslimat için sürekli perfüzyon gerektiren karmaşık bir organdır . , Karaciğer mikroyapı, doku mühendisliği ve imalat teknikleri kullanarak bir yaklaşım gerekçeleri ile birlikte yeniden ya da taklit etmek için çabaları şimdiye kadar bu tasarım sorunu nedeniyle başarılı olamamıştır. Buna ek olarak, karaciğer doku mühendisliği uygulamaları için iskeleler oluşturmak için kullanılan sentetik biyomateryaller uygun hücre fonksiyonlarını 2 neden belirli bir hücre bağlayıcı motifleri eksikliği nedeniyle büyük ölçüde doku rejenerasyonu ve onarım inducing sınırlı kalmıştır. Diğer taraftan Decellularized doğal dokular, kan damarları 3 ve 4 cilt, doku mühendisliği birçok uygulama var ve zorlukların bazı pratik bir çözüm sağladı . Decellularized yerli matris avantajı dolayısıyla hücre eki ve yeniden yapılanma 5 artırılması, bir ölçüde, orijinal kompozisyon ve mikroyapı korumasını.
Bu çalışmada biz büyük kan damarlarının yapısını korur sağlam bir karaciğer bioscaffold elde olduğu gibi, karaciğer perfüzyon decellularization, gerçekleştirmek için yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, in vitro fonksiyonel bir karaciğer grefti yetişkin birincil hepatositler bu bioscaffolds recellularize yöntemleri tarif ve in vivo nakli için gerekli damar erişimi vardır.
Protocol
1. Karaciğer Decellularization
- Portal ven kanülasyonu ve 18-gauge kateter ile sıçan karaciğer Hasat. Inferior ve superior vena kava açık bırakın. Organ sulu tutun fosfat tamponlu salin (PBS) 10 cm'lik petri.
- 8-litrelik rezervuar, peristaltik pompa ve bir baloncuk kapanı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun.
- Perfüzyon sistemi doldurun fosfat tamponlu salin ve 10 dakika boyunca çalışmaya devam. 10 cm'lik petri kaplarına PBS doldurun ve fosfat akış hızı 1 ml / dk tamponlu salin azaltmak.
- Dikkatlice hasat karaciğer transferi fosfat tamponlu tuzlu su dolu 10 cm'lik petri.
- Gecede PBS perfüzyon ile devam edin.
- Distile su içinde 5 dakika boyunca% 0,01 (w / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ile perfüzyon başlayın.
- PBS ile 1 saat serpmek.
- Her seferinde 10, 15 ve 20 dakika SDS perfüzyon süresi artan adımları 1.6 ve 1.7 üç kez daha tekrarlayın.
- 24 saat boyunca% 0,01 (w / v) SDS ile perfüzyon devam edin.
- 24 saat boyunca% 0.1 (w / v) SDS ile perfüzyon devam edin.
- 3 saat boyunca% 0.2 (w / v) SDS serpmek.
- 3 saat boyunca% 0.5 (w / v) SDS serpmek.
- Distile su ile 15 dakika boyunca serpmek.
- % 1 (w / v) distile su ile Triton X-100 ile bağlı herhangi bir nükleik asitlerin kaldırmak için 30 dakika boyunca serpmek.
- Decellularized karaciğer matrisi (DLM), 2 saat süreyle PBS ile serpmek yıkayın.
- İsteğe bağlı: median lob dışında bütün lobları rezeke.
- Kullanmak için hazır (Şekil 1) kadar 4 o C'de PBS batırılmış temiz ve mühürlü bir Petri kabındaki DLM saklayın .
- DLM sterilize etmek için: 1) steril PBS 4 o C'de% 0.1 (v / v) perasetik asit ve% 4 (v / v) etanol ve 3 saat inkübe içeren DLM yıkayın 2) steril PBS 2 kez yıkayın. 3)% 2 penisilin-streptomisin, 10ug / ml gentamisin ve 2.5 ug / ml amfoterisin B Store recellularization deneyler için kullanmaya hazır olana kadar 4 o C'de aynı çözüm decellularized karaciğer içeren steril PBS ile yıkayın.
2. Decellularized Karaciğer Matrix, Recellularization
- Perfüzyon odası, peristaltik pompa ve steril koşullar altında bir baloncuk tuzağı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. 200 ml kültür ortamı, örneğin, yüksek glukoz DMEM (Sigma),% 10 fetal sığır serumu (Hyclone), 100 U mL -1 penisilin ve 100 mg ml -1 streptomisin (Invitrogen) ile perfüzyon sistemi doldurun.
- Perfüzyon odasında decellularized karaciğer matris yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için 5 ml / dak pompa çalışırken portal ven kanül aracılığı ile perfüzyon sistemine DLM bağlamak.
- 30 dakika boyunca DLM yoluyla orta perfüzyon izin verin.
- En az% 90 canlılığı ile yetişkin bir fare primer hepatositlerde izole edin.
- Perfüzyon sistemi akışını durdurun ve perfüzyon sistemine yavaş yavaş balonu tuzak üzerinden 50 milyon hepatositler (1-3 ml kültür ortamı) enjekte edilir.
- 10 ml / dk akış başlayın ve 10 dakika boyunca orta sirküle.
- DLM (Şekil 2) 6 olmak üzere toplam 200 milyon hücre içine tanıtıldı kadar 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın.
- Bir kez tüm hücreleri DLM perfüze olan, 10 dakika boyunca 600 rpm'de dört adet 50-ml santrifüj tüplerine ve santrifüj perfüzat toplamak. Süpernatantlar atın ve tek bir tüp içine pelet toplamak. Tohumlama verimliliği belirlemek tripan mavi dışlama yoluyla hücreler ve canlılığı sayısını belirler.
3 Recellularized Karaciğer Greft Vitro Kültür
- Perfüzyon odası, steril koşullar altında (Şekil 3) peristaltik pompa, oksijenatör ve bir baloncuk kapanı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. 50 ml kültür ortamı ile perfüzyon sistemi doldurun, örneğin, Williams 'E (Sigma),% 5 fetal sığır serumu (Hyclone), 0.5 U mL -1 insülin (Eli Lilly), 20 ng mL-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml -1 glukagon (Bedford Laboratories), 7.5 mg mL -1 hidrokortizon (Pharmacia), 100 U mL -1 penisilin, ve 100 mg mL -1 streptomisin (Invitrogen).
- Perfüzyon odasında recellularized karaciğer greft yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için 5 ml / dak pompa çalışırken portal ven kanül aracılığı ile perfüzyon sistemine DLM bağlamak.
- Aseptik perfüzyon odasına yakın ve kültür sırasında herhangi bir sızıntıyı önlemek için sıkı bir şekilde yapışması.
- 37 o C ve% 10 CO bir kuluçka perfüzyon sistemi Transfer 2 ve 15 ml / dak perfüzyon akım hızı artırmak.
- % 95 O 2 ve% 5 CO 2 gaz karışımı tankı oksijenatör bağlayın ve gaz debisi 0.5 litre / dakikaya kadar ayarlayabilirsiniz. Bu approxima bir oksijen kısmi basıncı eldetely 400 mmHg.
- Kültür, kültür ortamı günlük değişiklikler ile 10 gün kadar devam edebilir. Kültür ortamı, albümin, üre ve toplam safra asit salgılanması gibi greft, karaciğer fonksiyonlarının izlenmesi için günlük numune olabilir. Recellularized karaciğer greft kültür dönemi sonunda, moleküler ve histolojik analiz için numune olabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Sıçan karaciğer decellularization açıklanan protokolünü kullanarak yaklaşık 72 saat sürer. Ortaya çıkan matris,% 100, fibriler kollajen glikozaminoglikanlar% 50 ve sadece% 5 yerli karaciğer DNA (Tablo 1) 6 korur . Matrisin vasküler yapı korozyona döküm ve taramalı elektron mikroskobu analizi (Şekil 4) 6 kanıtladığı gibi korunur. DLM içinde vasküler mikromimarisinin varlığı,% 96 verimlilik ve in vitro kültür için bir sonraki perfüzyon hücreleri ile repopulation kolaylaştırır. Recellularized karaciğer greft in vitro olarak 10 gün kadar kültürlü ve albümin, üre ve toplam safra asit salgılanması (Şekil 5) 6 üzerinden teyit uygun karaciğer fonksiyonları görüntüler olabilir.
Şekil 1 decellularization süreç sonunda karaciğer matris Decellularized. (A) tüm karaciğer rezeksiyonu sonrası (b), medyan lobu.
Şekil 2 DLM recellularization şematik.
Şekil 3 recellularized karaciğer greft in vitro kültürü Perfüzyon sistem kurulumu.
Şekil 4 mikrovasküler yapıyı decellularized karaciğer matris korunur. A) normal karaciğer b) decellularized karaciğer, portal (kırmızı) ve venöz (mavi) damarsal Korozyon döküm görüntüler. Tarama elektron mikroskobu görüntüleri DLM c) Bir gemi, d) safra kanalı gibi küçük damarlarda (oklar), Ölçek çubukları (a, b) 5 mm (c, d) 20 mikron bir bölüm.
Şekil 5 in vitro perfüzyon kültür sırasında recellularized karaciğer greft Karaciğer özel fonksiyonlar . a) albümin sekresyon (p = 0,5249), b) üre üretimi (p = 0,5271) ve c) toplam safra asit salgılanması (p = 0,0114). A = 0.01 Friedman testi ile 10 gün kültür dönemi boyunca deney ve kontrol arasındaki fark istatistiksel analizi yapıldı. Hata çubukları sem (n = 3) temsil eder.
| Taze livera | Decellularized karaciğer matris | p-değerleri | % Taze karaciğer | |
| n = 4 | n = 8 | |||
| Kollajen | 0.07 ± 0.01 | 0.08 ± 0.03 | 0,56 | % 114 |
| (G karaciğer mg) | ||||
| Glikozaminoglikanlar | 73.1 ± 6.7 | 34.2 ± 2.9 | 0,004 | % 47 |
| (G karaciğer mg) | ||||
| DNA | 14.9 ± 5.6 | 0.44 ± 0.08 | 3.3 10 -5 | % 2.9 |
| (G karaciğer mg) |
(Tablo 1). Decellularized karaciğer matris biyokimyasal bileşimi yerli karaciğer göre.
Değerler ortalama ± sem olarak temsil edilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan perfüzyon decellularization yöntemi aynı brüt yapısı ve yerli karaciğer vasküler mikromimarisini bir bütün karaciğer iskele üretir. Iskele yerli karaciğer benzer bir ekstrasellüler matriks kompozisyonu vardır. Recellularization yöntemi, yüksek verimliliği ve hücrelerin hücreleri in vitro kültür dönemde test sırasında uygulanabilir ve işlevsel kalır iskele repopulation ulaşır . Recellularized karaciğer dokusuna nonparenchymal hücrelerinin yanı sıra, biz recellularized karaciğer greft, ilaç metabolizması, yenilenme ve geliştirme gibi çeşitli karaciğer fonksiyonlarını incelemek için bir platform olarak kullanılan olabileceği öngörülüyor. Ayrıca, potansiyel bir alıcı hayvan greft 6 damar yapısının varlığı sayesinde kan dolaşımını bağlantısı üzerinden nakledilen olabilir bu yana recellularized greft, klinik uygulama bulabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, in vitro perfüzyon odasında tasarımı için Jack Milwid teşekkür etmek istiyorum . Bu çalışma, KU, ABD NSF CBET KU ve BEU Çocuklar için Shriners Hastaneler-0853569 MY, R00DK080942 R01DK59766 ve R01DK084053 ABD NIH, hibe (hibe hiçbir 8503) tarafından desteklenmiştir. Biz de destek ve Çocuklar için Shriners Hastaneler kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | EW-07523-80 | |
| Masterflex L/S Standard pump head | Cole-Parmer | EW- 07013-81 | |
| Bubble trap | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 |
References
- Kulig, K. M., Vacanti, J. P. Hepatic tissue engineering. Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).
- Schechner, J. S. Engraftment of a vascularized human skin equivalent. FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. , (2010).
Tags
Biyomühendislik Sayı 48 Karaciğer ekstrasellüler matriks decellularization recellularization hepatositler biyoreaktörErratum
Formal Correction: Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
A correction was made to Decellularization and Recellularization of Whole Livers. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.
