Summary
Введение гена в клетку является мощным средством для выяснения его функции в живом организме. Этот протокол описывает эффективный метод трансфекции культуры человека нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs) с использованием аппарата Nucleofector электропорации сделанные Amaxa.
Abstract
Трансфекция первичных нервных клеток млекопитающих, таких как человеческий нейронных стволовых / клеток-предшественников (hNSPCs), с часто используемыми катионных реагентов трансфекции липидного часто приводит к ухудшению жизнеспособности клеток и низкой эффективности трансфекции. Другие механические способы введения гена, таких, как пушка гена или микроинъекции, также ограничены плохой выживаемости клеток и небольшого числа трансфекции клеток. Стратегия использования вирусных конструкций ввести экзогенных генов в первичных клеток сдерживается как количество времени и труда, необходимые для создания вирусных векторов и потенциальные проблемы безопасности. Мы описываем здесь шаг за шагом протокол для трансфекции hNSPCs использованием Nucleofector устройство Amaxa и технологии с электрическим током параметров и буферных растворов, специально оптимизированных для трансфекции нервные стволовые клетки. Используя этот протокол, мы достигли начальной эффективности трансфекции ~ 35% и ~ 70% после стабильной трансфекции. Протокол подразумевает объединение большого числа hNSPCs с ДНК для трансфекции в соответствующий буфер следуют электропорации с Nucleofector устройства.
Protocol
Примечание: Обратитесь к пассажей правам нейронных стволовых клеток статьи ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) и подсчет правам нейронных стволовых клеток статьи ( http://www.jove.com / индекса / Details.stp? ID = 262 ), чтобы узнать, как ресуспендирования и считать hNSPCs.
Подготовка
- Убедитесь, что Есть много клеток для трансфекции (несколько миллионов клеток для каждого ДНК для трансфекции).
- Пальто блюдо культуры тканей, в которые трансфекции клетки будут посеяны, с 10 мкг / мл человеческого фибронектина ночь перед трансфекции. Право, прежде чем начать трансфекции протокола, удалите фибронектин, промыть посуду с PBS, и место культуры средств массовой информации в блюдо. Оставьте блюдо в 37 ° C культуре ткани инкубатора для теплого СМИ. Кроме того, место 1 мл культуральной среды в инкубаторе предварительного теплой до 37 ° C.
- Место ДНК (ы) для трансфекции, и трансфекции решение (от Amaxa), на льду.
Трансфекция
- Вымойте определенное количество клеток с PBS (мы обычно используем ~ 5 х 106 клеток на трансфекции). Гранул клетки центрифугированием (1000 оборотов в минуту (~ 200xg) в течение 5 минут), удалить как можно больше PBS насколько возможно, и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл трансфекции решение обеспечены трансфекции комплект. Передача клеточной суспензии в 1,7 мл трубки Эппендорф.
- Добавьте 5 мкл ДНК (~ 5-10 мкг ДНК на трансфекции) к клеточной суспензии и аккуратно перемешать.
- Использование Amaxa мини-пипетки, передачи клеточной ДНК смесь в кювет трансфекции Amaxa. Убедитесь, что 1 мл подогретого питательных сред для следующего шага. Кроме того, удалить ячейки блюдо с питательной среды из инкубатора и поместить его в капот культуры ткани.
- Место кювету в Nucleofector, вращать колесо по часовой стрелке, а затем выберите программу "-033". Нажмите клавишу Enter.
- Успешной трансфекции указывается наличие очень плотный слой пузырьков в верхней части раствора в кювете. Добавить 500 мкл теплой СМИ в кювет, и используя Amaxa мини-пипетки, передача трансфекции клеток в блюдо с подогретого СМИ. Промойте кювету с более теплым медиа и добавьте промыть к тому же блюдо. Место блюдо с ячейками в 37 ° C культуре ткани инкубатора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает сравнительно быстрого и эффективного трансфекции процедура hNSPCs. Используя эту процедуру, мы получили начальные эффективность трансфекции ~ 35%. Клетки трансфекции с помощью этой процедуры можно использовать для краткосрочных исследованиях (временно трансфекции клеток) или для долгосрочного исследования, если выбор агента используется для создания стабильно трансфицированных населения. Мы вызвали стабильно трансфицированных клеток, в которых ~ 70% от клетки экспрессируют экзогенных белков. В временно трансфекции hNSPCs, мы наблюдаем продолжающееся проявление экзогенных белков в течение ~ 7 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Филип Х. Шварца о человеческом нейронных стволовых клеток ресурсов в Детской больнице с, Orange County научно-исследовательский институт для обеспечения hNSPC культур.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
