Summary
एक सेल में ब्याज की एक जीन का परिचय vivo में अपनी समारोह elucidating के लिए एक शक्तिशाली विधि है. इस प्रोटोकॉल मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत (hNSPCs) कोशिकाओं Nucleofector electroporation Amaxa द्वारा बनाया तंत्र का उपयोग कर के एक संस्कृति transfecting का एक कारगर तरीका बताता है.
Abstract
प्राथमिक मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत (hNSPCs) आमतौर पर इस्तेमाल किया धनायनित लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ कोशिकाओं, जैसे स्तनधारी तंत्रिका कोशिकाओं, के अभिकर्मक अक्सर गरीब सेल व्यवहार्यता और कम अभिकर्मक दक्षता में हुई है. ब्याज की एक जीन, जैसे, एक जीन बंदूक या microinjection शुरू करने के अन्य यांत्रिक तरीकों को भी गरीब सेल व्यवहार्यता और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की कम संख्या के द्वारा सीमित हैं. वायरल constructs का उपयोग करने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं में एक exogenous जीन परिचय की रणनीति दोनों समय और श्रम की राशि वायरल vectors और संभावित सुरक्षा चिंताओं को बनाने के लिए आवश्यक द्वारा विवश है. हम यहाँ बिजली के वर्तमान मापदंडों और बफर समाधान विशेष रूप से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं transfecting के लिए अनुकूलित के साथ Amaxa Nucleofector डिवाइस और प्रौद्योगिकी का उपयोग करने hNSPCs transfecting के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम ~ 35% के प्रारंभिक अभिकर्मक क्षमता हासिल किया है और स्थिर अभिकर्मक के बाद 70% ~. प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त Nucleofector डिवाइस के साथ electroporation द्वारा पीछा बफर में ट्रांसफ़ेक्ट हो डीएनए के साथ hNSPCs के एक उच्च संख्या के संयोजन जरूरत पर जोर देता है.
Protocol
नोट: passaging मानव तंत्रिका स्टेम सेल (लेख का संदर्भ लें http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) और गिनती मानव तंत्रिका स्टेम सेल (लेख http://www.jove.com / / सूचकांक Details.stp आईडी = 262 ) के लिए सीखने के लिए कैसे और resuspend hNSPCs गिनती.
तैयार
- सुनिश्चित करें कि वहाँ अभिकर्मक के लिए उपलब्ध कोशिकाओं के बहुत सारे हैं (प्रत्येक डीएनए के लिए कई लाख कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट).
- कोट एक ऊतक संस्कृति डिश है, जो कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट 10 μg / एमएल मानव fibronectin अभिकर्मक पहले रात के साथ हो सकता है, वरीयता प्राप्त होगा. अभिकर्मक प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले ठीक है, fibronectin हटायें, पीबीएस के साथ पकवान कुल्ला, और पकवान में जगह संस्कृति मीडिया. मीडिया गर्म 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में पकवान छोड़ो. इसके अलावा, इनक्यूबेटर में 37 पूर्व गर्म ° सी. संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर जगह
- डीएनए (ओं) ट्रांसफ़ेक्ट हो सकता है, और अभिकर्मक (Amaxa से) बर्फ पर समाधान रखें.
अभिकर्मक
- पीबीएस (हम आम तौर पर 5 ~ अभिकर्मक प्रति x 106 कोशिकाओं का उपयोग) के साथ कोशिकाओं के एक निर्धारित संख्या धो लें. गोली centrifugation (5 मिनट के लिए 1000 rpm (~ 200xg)) द्वारा कोशिकाओं के रूप में संभव के रूप में ज्यादा पीबीएस निकालने के लिए, और 100 अभिकर्मक अभिकर्मक किट के साथ प्रदान की समाधान के μl में सेल गोली resuspend. एक 1.7 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
- सेल निलंबन के लिए डीएनए के 5 μl (~ 5-10 μg अभिकर्मक प्रति डीएनए की) जोड़ें और मिश्रण धीरे.
- Amaxa मिनी - विंदुक का प्रयोग, Amaxa अभिकर्मक क्युवेट में सेल डीएनए मिश्रण का हस्तांतरण. सुनिश्चित करें कि आप अगले कदम के लिए पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर है. इसके अलावा, संस्कृति मीडिया के साथ इनक्यूबेटर से सेल पकवान और हटाने टिशू कल्चर हुड में यह जगह.
- Nucleofector में क्युवेट प्लेस घुमाएगी, पहिया दक्षिणावर्त, और कार्यक्रम "A-033" चुनें. Enter दबाएँ.
- एक सफल अभिकर्मक क्युवेट में समाधान के शीर्ष पर एक बुलबुले के एक बहुत ही घने परत की उपस्थिति ने संकेत दिया है. क्युवेट में 500 μl गर्म मीडिया जोड़ें, और Amaxa मिनी - पिपेट का उपयोग करने के लिए, पूर्व गर्म मीडिया के साथ डिश में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं हस्तांतरण. अधिक गर्म मीडिया के साथ क्युवेट कुल्ला और एक ही थाली में कुल्ला जोड़ने. 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ पकवान प्लेस.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल hNSPCs के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और कुशल अभिकर्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है. इस प्रक्रिया का उपयोग करना, हम ~ 35% के प्रारंभिक अभिकर्मक क्षमता प्राप्त की है. इस प्रक्रिया द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट कक्ष अल्पकालिक अध्ययनों (transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं) के लिए या लंबी अवधि के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक चयन एजेंट एक stably ट्रांसफ़ेक्ट जनसंख्या उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम stably ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में जो कोशिकाओं के 70% ~ exogenous प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न किया है. Transiently ट्रांसफ़ेक्ट hNSPCs में, हम ~ 7 दिनों के लिए exogenous प्रोटीन की निरंतर अभिव्यक्ति मनाया गया है.
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Acknowledgments
लेखकों के लिए बच्चों के अस्पताल, ऑरेंज काउंटी hNSPC संस्कृतियों प्रदान करने के लिए अनुसंधान संस्थान में राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन के डॉ. फिलिप एच. Schwartz स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
