Summary
셀에 관심 유전자를 소개하면 생체내 년에 기능을 elucidating위한 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 Amaxa 만든 Nucleofector electroporation 장치를 사용하여 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)의 문화를 transfecting의 효율적인 방법을 설명합니다.
Abstract
이러한 일반적으로 사용되는 양이온 지질 transfection의 시약과 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)로 기본 포유류의 신경 세포의 Transfection은 종종 가난한 세포 생존 능력과 낮은 transfection 효율 결과입니다. 이러한 유전자 총을 또는 microinjection 같은 관심의 유전자를, 도입의 다른 기계적 방식은 또한 가난한 세포 생존과 transfected 세포의 낮은 숫자로 제한됩니다. 기본 세포로 외인성 유전자를 도입 바이러스 구조를 사용하는 전략은 바이러스 벡터 및 잠재적인 안전 문제를 만드는 데 필요한 시간의 금액과 노동 모두에 의해 제약되었습니다. 우리는 여기서 특별히 신경 줄기 세포를 transfecting에 최적화된 전류 매개 변수 및 버퍼 솔루션으로 Amaxa의 Nucleofector 장치와 기술을 사용하여 hNSPCs을 transfecting위한 단계별 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 ~ 35 %의 초기 transfection 효율을 달성하고 안정적인 transfection 후 70 % ~했습니다. 프로토콜은 장치와 함께 Nucleofector electroporation 다음 해당 버퍼에 transfected하는 DNA와 hNSPCs 높은 숫자를 결합 알아볼 수 있습니다.
Protocol
참고 : Passaging 인간 신경 줄기 세포 문서 (참조 http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) 및 계산 인간 신경 줄기 세포 문서 ( http://www.jove.com / 색인 / Details.stp? ID = 262 hNSPCs을 resuspend하고 계산하는 방법을 알아보려면).
준비
- transfection에 사용할 세포의 많은 (각 DNA를 수백만 세포 transfected 수)가있다는 것을 확인하십시오.
- transfected 세포가 10 μg / ML 인간 fibronectin transfection 전날 밤 함께 씨앗을하게됩니다으로 코팅 조직 문화 요리. 오른쪽 transfection 프로토콜을 시작하기 전에, fibronectin을 제거 PBS로 접시를 씻어하고 접시에 장소 문화 미디어. 미디어를 따뜻하게하기 위해 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에있는 접시를 남겨주세요. 또한, 37 미리 따뜻한 ° C.하는 보육 문화 미디어 1 ML을 배치
- transfected로 DNA (들), 그리고 얼음에 transfection 솔루션 (Amaxa에서), 장소.
Transfection
- PBS (우리가 일반적으로 X 106 세포 transfection 회 ~ 5 사용)과 함께 세포의 정의된 번호를 씻으십시오. 펠렛 원심 분리 (5 분 1,000 RPM (~ 200xg))에 의해 세포, 가능한 한 많은 PBS로 제거하고, transfection 키트와 함께 제공되는 transfection 솔루션 100 μl의 세포 펠렛을 resuspend. 1.7 ML eppendorf 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 세포 현탁액에 DNA 5 μl를 (transfection마다 DNA의 ~ 50-10 μg) 추가하고 부드럽게 섞는다.
- Amaxa 미니 피펫을 사용하여 Amaxa의 transfection의 쿠베트에 세포 DNA 믹스를 전송할 수 있습니다. 당신이 다음 단계에 대한 사전 예열 문화 미디어 1 ML을 가지고 있는지 확인하십시오. 또한, 인큐베이터에서 문화 매체와 세포 접시를 제거하고 조직 문화 후드에 놓으십시오.
- Nucleofector에 쿠베트를 놓고, 바퀴가 시계 방향으로 회전 및 프로그램 "A - 033"을 선택하십시오. 를 입력한 다음 Enter 키를 누릅니다.
- 성공적인 transfection은 쿠베트의 솔루션 위에 거품이 매우 고밀도 레이어의 존재로 표시됩니다. 쿠베트에 500 μl 따뜻한 미디어를 추가하고 Amaxa 미니 피펫을 사용하여 미리 예열 미디어 함께 그릇에 transfected 세포를 전송합니다. 더 따뜻한 미디어 쿠베트을 씻어 같은 접시에 린스를 추가합니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터의 세포와 접시를 놓습니다.
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Discussion
이 프로토콜은 hNSPCs에 대해 상대적으로 신속하고 효율적인 transfection 절차를 설명합니다. 이 절차를 사용하여, 우리는 ~ 35 %의 초기 transfection 효율을 획득했습니다. 선택 에이전트가 안정 transfected 인구를 생성하는 데 사용되는 경우에는이 절차에 의해 transfected 세포 단기 연구 (transiently transfected 세포) 또는 장기적인 연구에 사용될 수 있습니다. 우리는 외인성 단백질을 표현하는 세포의 70 %를 ~하는 안정 transfected 세포를 생성합니다. transiently transfected hNSPCs, 우리는 ~ 7 일 동안 외인성 단백질의 지속적인 표현을 관찰했습니다.
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Acknowledgments
저자는 어린이의 병원, hNSPC 문화를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
