Summary
La introducción de un gen de interés en una célula es un poderoso método para dilucidar su función en vivo. Este protocolo describe un método eficaz para la transfección de una cultura de derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs) utilizando el aparato de electroporación Nucleofector hecha por Amaxa.
Abstract
La transfección de células primarias de mamífero neural, como la humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), con reactivos de uso común lípido catiónico transfección a menudo ha resultado en la viabilidad celular pobres y la eficiencia de transfección de baja. Otros métodos mecánicos de la introducción de un gen de interés, tales como una pistola de genes o de la microinyección, también están limitados por la viabilidad celular pobres y un bajo número de células transfectadas. La estrategia de utilizar las construcciones virales para introducir un gen exógeno en las células primarias se ha visto limitada tanto por la cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para crear vectores virales y posibles problemas de seguridad. Se describe aquí un protocolo de paso a paso para la transfección hNSPCs con dispositivo Nucleofector Amaxa y la tecnología eléctrica con los parámetros actuales y las soluciones buffer optimizado específicamente para la transfección de células madre neurales. El uso de este protocolo, que han alcanzado eficiencias de transfección inicial de ~ 35% ~ 70% y después de la transfección estable. El protocolo implica la combinación de un elevado número de hNSPCs con el ADN que se transfectadas en el tampón adecuado seguido por electroporación con el dispositivo Nucleofector.
Protocol
Nota: Consulte la pases Humanos troncales nerviosas artículo células ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) y el conteo Humanos troncales nerviosas artículo células ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) para aprender a volver a suspender y contar hNSPCs.
Preparación
- Asegúrese de que hay un montón de células disponibles para la transfección (varios millones de células por cada ADN se transfectadas).
- Cubra un plato de cultivo de tejidos, en la que las células transfectadas será cabeza de serie, con 10 mg / ml fibronectina humana la noche antes de la transfección. Justo antes de iniciar el protocolo de transfección, retire la fibronectina, enjuagar el recipiente con PBS, y los medios de comunicación sitúan la cultura en el plato. Deja el plato en el 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos para calentar los medios de comunicación. Además, colocar 1 ml de medio de cultivo en la incubadora para pre-calentar a 37 º C.
- Coloque el ADN (s) para ser transfectadas, y la solución de transfección (de Amaxa), en el hielo.
Transfección
- Lavar un número determinado de células con PBS (por lo general el uso ~ 5 x 106 células por transfección). Precipitar las células por centrifugación (1000 rpm (~ 200xg) durante 5 minutos), eliminar la mayor cantidad posible de PBS y resuspender el botón celular en 100 l de la solución de transfección suministrado con el kit de transfección. La transferencia de la suspensión de células a un tubo de 1,7 ml eppendorf.
- Añadir 5 l de ADN (~ 5-10 ug de ADN por transfección) a la suspensión celular y mezclar suavemente.
- Utilizando el mini-Amaxa pipeta, transferir la mezcla de células de ADN en una cubeta de transfección Amaxa. Asegúrese de que tiene de 1 ml de medio de cultivo pre-calentado para el siguiente paso. También, retirar la cápsula de células con medio de cultivo de la incubadora y colocarlo en la capilla de cultivo de tejidos.
- Coloque la cubeta en el Nucleofector, gire la rueda hacia la derecha, y seleccionar el programa "A-033". Pulse Intro.
- Un éxito de la transfección se indica por la presencia de una capa muy densa de burbujas en la parte superior de la solución en la cubeta. Añadir 500 l de medios cálidos en la cubeta, y con el mini-Amaxa pipeta, transferir las células transfectadas en el plato, pre-calentado los medios de comunicación. Enjuague el tubo con los medios de comunicación más caliente y añadir el enjuague para el mismo plato. Coloque el plato con las células en los 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos.
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Discussion
Este protocolo describe un procedimiento de transfección relativamente rápido y eficaz para hNSPCs. El uso de este procedimiento, se han obtenido eficiencias de transfección inicial de ~ 35%. Las células transfectadas por este procedimiento puede ser utilizado para estudios a corto plazo (células transfectadas transitoriamente) o para estudios a largo plazo si un agente de selección se utiliza para generar una población transfectadas establemente. Hemos generado células transfectadas establemente en el que ~ 70% de las células que expresan la proteína exógena. En hNSPCs transfectadas transitoriamente, se ha observado la expresión continua de la proteína exógena de ~ 7 días.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital Infantil s, Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar culturas hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
