Summary
L'introduction d'un gène d'intérêt dans une cellule est une méthode puissante pour élucider sa fonction in vivo. Ce protocole décrit une méthode efficace de transfection d'une culture de souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs) en utilisant l'appareil d'électroporation Nucleofector faite par Amaxa.
Abstract
La transfection de cellules neurales primaires de mammifères, tels que souches neurales humaines / cellules précurseurs (hNSPCs), avec couramment utilisés cationiques réactifs de transfection des lipides a souvent abouti à la viabilité des cellules pauvres et à faible efficacité de la transfection. D'autres méthodes mécaniques de l'introduction d'un gène d'intérêt, comme un canon à gènes ou de micro-injection, sont également limitées par la viabilité des cellules pauvre et le faible nombre de cellules transfectées. La stratégie consistant à utiliser des vecteurs viraux pour introduire un gène exogène dans les cellules primaires a été freinée par deux la quantité de temps et le travail requis pour créer des vecteurs viraux et de problèmes de sécurité potentiels. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour la transfection en utilisant un dispositif hNSPCs Nucleofector Amaxa et technologie avec les paramètres électriques actuels et solutions tampon spécialement optimisé pour la transfection des cellules souches neurales. En utilisant ce protocole, nous avons atteint des efficacités de transfection initiale de ~ 35% et ~ 70% après transfection stable. Le protocole implique la combinaison d'un nombre élevé de hNSPCs avec l'ADN à transfecter dans le tampon approprié suivie par électroporation avec l'appareil Nucleofector.
Protocol
Note: Se référer à l'article de repiquage neuronaux humains Cellules souches ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) et le comptage de l'homme souches neurales l'article Cells ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) pour apprendre à resuspendre et compter hNSPCs.
Préparation
- Assurez-vous qu'il ya beaucoup de cellules disponibles pour la transfection (plusieurs millions de cellules pour chaque ADN à transfecter).
- Enduire un plat de culture de tissu, dans lequel les cellules transfectées seront ensemencés, avec 10 ug / ml de fibronectine humaine la nuit avant la transfection. Juste avant de commencer le protocole de transfection, retirer la fibronectine, rincer la vaisselle avec du PBS, et milieux de culture dans le plat. Laissez le plat dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire pour réchauffer les médias. Aussi, placer 1 ml de milieux de culture dans l'incubateur pour préchauffer à 37 ° C.
- Placez l'ADN (s) à transfecter, et la solution de transfection (à partir Amaxa), sur la glace.
La transfection
- Laver un nombre défini de cellules avec du PBS (nous utilisons habituellement ~ 5 x 106 cellules par transfection). Pellet les cellules par centrifugation (1000 rpm (~ 200xg) pendant 5 minutes), enlever autant que possible du PBS, et remettre le culot cellulaire dans 100 pl de la solution de transfection fourni avec le kit de transfection. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,7 ml Eppendorf.
- Ajouter 5 ul de l'ADN (~ 5-10 mg d'ADN par transfection) à la suspension cellulaire et mélanger doucement.
- Utilisation de la mini-Amaxa pipette, transférer le mélange de cellules-ADN dans la cuvette de transfection Amaxa. Assurez vous d'avoir 1 ml de milieux de culture pré-chauffé pour la prochaine étape. Aussi, retirez le plat cellule avec des milieux de culture de l'incubateur et placez-le dans la hotte de culture de tissus.
- Placer la cuvette dans l'Nucleofector, tournez la molette vers la droite, et sélectionnez le programme "A-033". Appuyez sur Entrée.
- Une transfection réussie est indiquée par la présence d'une couche très dense de bulles sur le dessus de la solution dans la cuvette. Ajouter 500 ul média chaud dans la cuvette, et en utilisant le mini-Amaxa pipette, transférer les cellules transfectées dans le plat avec préchauffé médias. Rincer la cuvette avec des médias plus chaude et ajoutez l'eau de rinçage pour le même plat. Placer le plat avec des cellules dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode de transfection relativement rapide et efficace pour hNSPCs. En utilisant cette procédure, nous avons obtenu des efficacités de transfection initiale de ~ 35%. Les cellules transfectées par cette procédure peut être utilisée pour études à court terme (les cellules transfectées de façon transitoire) ou pour des études à long terme si un agent de sélection est utilisée pour générer une population transfectées de façon stable. Nous avons généré des cellules transfectées de façon stable dans lequel environ 70% des cellules expriment la protéine exogène. En hNSPCs transfectées de façon transitoire, nous avons observé l'expression continue de la protéine exogène pour ~ 7 jours.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Philip H. Schwartz, de la National des Ressources Humaines des cellules souches neurales à l'Hôpital des enfants s, Orange County Institut de recherche pour fournir des cultures hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
