Summary
Die Einführung eines Gens in eine Zelle ist eine leistungsfähige Methode für die Aufklärung ihrer Funktion in vivo. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Transfektion von einer Kultur des menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) mit Hilfe der Elektroporation Nucleofector Apparat Amaxa gemacht.
Abstract
Transfektion von primären Säugerzellen neuronalen Zellen, wie die menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), mit häufig verwendeten kationischen Lipid Transfektionsreagenzien oft in armen Lebensfähigkeit der Zellen und geringe Transfektionseffizienz geführt. Andere mechanische Verfahren zur Einführung eines Gens von Interesse, wie eine Gen-Kanone oder Mikroinjektion werden zudem durch eine schlechte Lebensfähigkeit der Zellen und niedrigen Zahlen von transfizierten Zellen begrenzt. Die Strategie der Verwendung von viralen Konstrukte eines exogenen Gens in primären Zellen einzuschleusen wurde sowohl von der Höhe der Zeit und Arbeit erforderlich, um virale Vektoren und mögliche Sicherheitsprobleme zu schaffen gezwungen worden. Wir beschreiben hier eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Transfektion von hNSPCs mit amaxas Nucleofector Gerät und Technologie mit elektrischem Strom Parameter und Puffer-Lösungen speziell für die Transfektion von neuronalen Stammzellen optimiert. Unter Verwendung dieses Protokolls haben wir erste Transfektionseffizienz von ~ 35% erreicht und ~ 70% nach stabiler Transfektion. Das Protokoll beinhaltet die Kombination einer hohen Anzahl von hNSPCs mit der DNA in den entsprechenden Puffer durch Elektroporation mit dem Nucleofector Gerät gefolgt transfiziert werden.
Protocol
Hinweis: Beachten Sie die Passagierung Nervenstammzellen Artikel ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) und die Counting Nervenstammzellen Artikel ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) zu lernen, wie resuspendieren und zählen hNSPCs.
Vorbereitung
- Stellen Sie sicher, dass es viele von Zellen für die Transfektion (mehrere Millionen Zellen pro DNA transfiziert werden).
- Coat ein Gewebe Kulturschale, in die die transfizierten Zellen ausgesät, wird mit 10 pg / ml humanem Fibronectin in der Nacht vor der Transfektion werden. Kurz vor dem Start der Transfektion Protokoll, entfernen Sie die Fibronektin, spülen Sie die Schale mit PBS, Ort und Kulturmedien in die Schüssel. Lassen Sie die Schale in den 37 ° C Gewebekultur-Inkubator für die Medien warm. Auch Platz 1 ml Kulturmedium in den Inkubator zur Vorwärmung auf 37 ° C.
- Legen Sie die DNA (s) zum transfiziert werden, und die Transfektion Lösung (von Amaxa), auf Eis.
Transfektion
- Wash eine definierte Anzahl von Zellen mit PBS (verwenden wir im Allgemeinen ~ 5 x 106 Zellen pro Transfektion). Pellet die Zellen durch Zentrifugation (1000 rpm (~ 200xg) für 5 Minuten), so viel PBS wie möglich zu entfernen, und das Zellpellet in 100 ul der Transfektion Lösung mit der Transfektion Kit zur Verfügung gestellt. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Add 5 ul der DNA (~ 5-10 ug DNA pro Transfektion) zur Zellsuspension und vorsichtig mischen.
- Mit dem Amaxa Mini-Pipette die Zell-DNA-Mix in den Amaxa Transfektion Küvette. Vergewissern Sie sich, 1 ml vorgewärmtes Kulturmedium für den nächsten Schritt. Entfernen Sie außerdem die Zelle Gericht mit Kulturmedien aus dem Inkubator und legen Sie sie in der Gewebekultur Kapuze.
- Setzen Sie die Küvette in die Nucleofector, drehen Sie das Rad im Uhrzeigersinn, und wählen Sie Programm "A-033". Drücken Sie die Eingabetaste.
- Eine erfolgreiche Transfektion wird durch die Anwesenheit eines sehr dichten Schicht von Blasen auf der Oberseite der Lösung in der Küvette angegeben. Add 500 ul warmen Medien in die Küvette, und mit dem Amaxa Mini-Pipette die transfizierten Zellen in die Schüssel mit vorgewärmten Medien. Spülen Sie die Küvette mit mehr warme Medien und fügen Sie die auf die gleiche Gericht zu spülen. Die Schale mit den Zellen in die 37 ° C Gewebekultur-Inkubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine relativ schnelle und effiziente Verfahren für die Transfektion hNSPCs. Mit diesem Verfahren haben wir zunächst Transfektionseffizienz von ~ 35% erhalten. Zellen, die durch dieses Verfahren transfizierten kann für kurzfristige Studien (transient transfizierten Zellen) oder für eine längerfristige Studien verwendet werden, wenn eine Auswahl Agent wird verwendet, um eine stabil transfizierte Bevölkerung zu generieren. Wir haben stabil transfizierten Zellen, in denen 70% der Zellen ~ drücken die exogene Protein erzeugt. In transient transfizierten hNSPCs, haben wir weiterhin die Expression des exogenen Protein für ~ 7 Tage beobachtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen auf die Kinder s Hospital, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen anzuerkennen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
