Summary
כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.
Abstract
עולם החי של ריחות מוכר על ידי תחושת olfaction. Olfaction בעכברים מתווך על ידי רפרטואר של כ 1200 רצפטורים G חלבון יחד (GPCRs) 1, כי הם הניחו לקשור מולקולות odorant נדיפים המרת אותות תאיים לתוך האות תאיים על ידי צימוד עם חלבון G Gαolf. עקידת odorants אל קולטנים הוא חשב ללכת כלל קומבינטורית, כלומר, אחד odorant עלולים להיקשר לקולטנים מספר אחד יכול להיקשר לקולטן odorants מספר בדרגות 2. אותות ביוכימיים, ומחקרים מחייב ליגנד בוצעו בנוחות החוצה GPCRs ביותר באמצעות תאים Heterologous. אולם השימוש בתאי Heterologous למחקר של קולטנים odorant, היתה מנועה במשך זמן רב מאז על transfection הצליחו לייצא אל פני השטח. סאיטו et al הראו קרום יחיד לעבור הובלת חלבון קולטן (RTP) מלווים המשפחה להראות ביטוי משופרת הנוירונים חושי הריח ולפעול מלווים כדי odorant קולטני תנועה על פני השטח בתאים Heterologous, כאשר שיתוף transfected יחד 3. כדי לבצע את מבחני ביוכימיים עבור הקולטנים באמצעות תאים Heterologous, יש לקבוע תחילה אם הקולטן מראה ביטוי משטח יציב בקו התא. זה יכול להיות assayed ידי overexpressing את הקולטנים עם RTP1S המלווה ואחריו תא חי מכתים את fluorescently התווית תחום תאי או תג בתחום תאיים בלבד. כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.
Protocol
1. נוהל:
ההליך מורכב משלושה חלקים הושלמה לאורך זמן כולל של 3 ימים: העברת תאים, transfection ו immunocytochemistry, צעד אחד ביצע ליום. העברת transfection של תאים במהלך היומיים הראשונים חייב להתבצע בתנאים סטריליים בחדר זרימה למינרית.
יום 1: העברה של תאים HEK293T עבור assay ביטוי על פני השטח.
- העברת בינוני (M10): מערבבים מדיום חיוני מינימום בתוספת 10% (לפי נפח) בסרום שור העובר במצב סטרילי.
- לגדל תאים confluency הרצוי בצלחת תרבות 100mm, תלוי במספר צלחות נדרש להגדיר. חשוב לקבוע את החלק היחסי של התאים יועברו כדי למנוע תאים מגודל או דליל: למשל, מתוך צלחת 100% ומחוברות 100 מ"מ, ניתן להעביר כ -3% לצלחת 35 מ"מ לקבל כ -30% confluency ב האחרון.
- לפני העברת תאים, תא זרימה למינרית סטרילי, מעיל 22 X 22 מ"מ זכוכית עם מכסה מחליק סטרילי פולי D ליזין (1 מ"ג / מ"ל) ומקום אחד לכל צלחת 35 מ"מ בתא תרבות, הצד המצופה כלפי מעלה עבור תאים ציפוי (איור 1 ). אפשר פתרון להתייבש במשך 5 - 10 דקות. במהלך ההפסקה הזו, מקור UV בחדר למינרית עשוי להיות מופעל כדי לעקר את תלושי לכסות, אם תרצה בכך. פולי D ליזין מסייעת לתאי Heterologous להיצמד מחליק המכסה.
- כדי להעביר תאים, לשאוב את המדיה הקיימים בצלחת 100mm, לשטוף היטב על ידי הוספת 8 מ"ל סטרילי PBS, לשאוב PBS ו trypsinize התאים באמצעות 3 mL 0.05% טריפסין-EDTA, כאשר תאים להתנתק המנה, לחסום תגובה אנזימטית נוספת על ידי הוספת 5 מ"ל M10. Triturate התאים והעברת נפח הדרושים צינור חרוטי סטרילית; צנטריפוגות ב 200 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים. לשאוב את supernatant המכילה טריפסין-EDTA, עוזב את גלולה של תאים שלמים. כדי להעביר את התאים 35 מנות מ"מ, להוסיף 1 מ"ל M10 עבור כל מאכל triturate לנתק את התאים. הוסף 1 מ"ל של תאים resuspended על כל מנה. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2.
באיור 1. Coat 22 X 22 מ"מ זכוכית coverslips עם פולי D ליזין ומקום צד אחד מצופה בתוך כל מנה 35 מ"מ.
יום 2: transfection של תאים HEK293T.
- 18-24 שעות לאחר העברת התאים מוכנים transfection של הקולטן להיות assayed. השתמש הקולטן RTP1S משובטים של יונקים ביטוי וקטור PCI, מוכן מתרבויות חיידקי באמצעות Qiagen Miniprep פרוטוקול ערכת הבאים תיאר לפני 4. השתמש קולטנים הנמצאים N מתויג סופני עם 20 חומצה אמינו ארוך rhodopsin epitope כדי להקל immunostaining.
- השתמש 1000ng של קולטן לבנות, 250 ננוגרם של RTP1S לבנות 50 ng של חלבון פלואורסצנטי ירוק כל transfection. בצע transfection באמצעות Lipofectamine 2000, לפי הוראות היצרנים.
יום 3: Immunocytochemistry לחזות פני התא קולטנים מוכתם.
- לפני שמתחילים, להכין מכתים ושטיפת פתרונות מגניב להם 4 ° C. מכתים בינוני: בינוני Essential Minimum, 45 מ"ל, סרום שור עוברית, 5 מ"ל; HEPES (1M), 500 μL (הריכוז הסופי 10mm); אזיד הנתרן (1.5M), 500 (ריכוז סופי 15mm) μL. לשטוף פתרון: HBSS, 500 מ"ל; HEPES (1M), 5 מ"ל (ריכוז 10mm הסופי); אזיד הנתרן (1.5M), 5 מ"ל (ריכוז סופי 15mm). שני הפתרונות עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר. הכינו פתרונות נוגדנים על ידי דילול נוגדנים הנדרשים לקפל בינוני 100 מכתים.
- התחל immunochemistry עבור מכתים משטח קולטנים odorant על transfection 24 שעות הודעה. כדי לבצע מכתים תא חי, להגדיר את הניסוי חייב להיות מקורר 4 ° C: למלא גדול שהכיל קרח וללטף את פני השטח של קרח כדי לעשות את זה כמו גם ככל האפשר, במקום המגש על הקרח לרסס אותו עם 70% אתנול. חותכים פיסת parafilm (קטן יותר מאשר אורך המגש) ו להטביע אותו על מגש אתנול מרוסס, על מנת לקבל משטח חלק. העברת את מכסה זכוכית תלושי המכיל תאים transfected על parafilm, אחד בכל פעם, לצד התא למעלה, באמצעות פינצטה. שכבה לכסות כל להחליק עם פתרון 100 מכתים קר μL העיקרי, extruding בזהירות מפינת בתלוש (איור 2). אחרי כל שכבות תלושי לכסות עם פתרון נוגדן, מכסים את המגש כדי למנוע התייבשות של התמיסה באוויר. ביצוע הדגירה העיקרי 45-60 דקות.
- לאחר הדגירה העיקרי, במהירות העברת תלושי לכסות את הכלים המקוריים תרבות 35mm, המכיל את התקשורת. לשאוב התקשורת להוסיף 2 פתרון מקורר מ"ל לשטוף בעדינות מהקצה של המנה, כדי למנוע אובדן תאים להחליק את המכסה. לשאוב את הפתרון לשטוף וחזור פעמיים כדי להשלים שלוש שוטף. בסיום לשטוף את השלישי, שלא ישאפו הפתרון לשטוף החוצה.
- הכינו נוגדנים soluti משניעל בתקשורת מכתים ולהעביר את תלושי לכסות מפתרון לשטוף לשכבה parafilm מודבקת החדש במגש אותו. שוב בעדינות extrude 100 μL של פתרון נוגדנים כדי להחליק כל שכבת כיסוי, מפינת כמו הדגירה הראשי. ביצוע הדגירה המשני למשך 30 - 45 דקות ולהעביר חזרה הפתרון לשטוף את 35 מנות מקוריות מ"מ. שוב לשטוף לכסות את תלושי שלוש פעמים כמתואר.
- לשאוב לשטוף פתרון מן לשטוף האחרון ולהוסיף 2 paraformaldehyde מ"ל מקורר 1%. תקן תאים פתרון מקורר paraformaldehyde 1%, על קרח במשך 15 דקות.
- הר תלושי לכסות על זכוכית מיקרוסקופ נקי שקופיות באמצעות Mowiol מגיב גובר, עם הצד תא למטה בזהירות להוציא את כל בועות האוויר (איור 3). מתייבש באוויר Mowiol פעם, לשטוף תלושי לכסות בעדינות על ידי הוספת מים מזוקקים על פני השטח aspirating מיד.
איור 2. Layer כל coverslip עם פתרון 100 מכתים קר μL העיקרי.
איור 3. הר coverslips עם הצד התא על מיקרוסקופ זכוכית נקי שקופיות באמצעות ריאגנט הרכבה Mowiol.
2. נציג תוצאות:
מכתים תא חי מאפשרת לחזות חלבונים על פני השטח של תאים, על transfection של קולטנים עם המלוות (ב קולטן זה מקרה odorant Olfr62, עם RTP1S הובלת חלבון קולטן) (איור 4). משטח נייד מכתים של קולטנים מאופיין דפוס punctate של הכתמה (איור 4B, הבלעה). מכתים בוצעו בצורה בלתי הולמת עלולה לגרום לרעש גבוה יותר, מה שהקשה על הצופה להבחין מכתים משטח אמיתי מרעש. 
איור 4. Transfection של קולטנים עם המלוות מאפשר הדמיה של חלבונים על פני השטח של תאים באמצעות מכתים תא חי. Transfection של הקולטן odorant Olfr62 לבד (א) ו transfection של Olfr62 עם המלווה RTP1S (B). רמות ה-GFP ביטוי לשמש שליטה transfection (א 'ו - ב').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כל צעד חייב להתבצע בקפידה כדי להבטיח מכתים משטח בולט וייחודי. התהליך מכתים כולו צריך להתבצע קר (על הקרח), וכן את המגש על אשר מחליק לכסות מוטלות חייב להיות מקורר לפני השימוש כדי להבטיח תאים להישאר בחיים. יתר על כן קיבוע נעשה בסוף התהליך מכתים פני השטח. זהו ניגוד חריף עם צביעה פנימית, בו קיבעון מקדים מכתים את permeabilize קרום התא נוגדנים ראשוניים ומשניים. זמן החשיפה של תלושי לכסות האוויר חייב להיות ממוזער כדי למנוע את התאים מפני התייבשות, ולכן שכבות של תלושי לכסות עם פתרונות נוגדנים, העברת תלושי לכסות לשטוף את הפתרון, החלפת פתרון לרחוץ בין שוטף חייב להיעשות במהירות, אחד בכל פעם בעת הטיפול מחליק לכסות מרובים.
בהתאם לתג ונוגדנים epitope אדם משתמש, אחד אולי להתאים זמן הדגירה, מספר שוטף, ומקפלים של דילול נוגדן. רעש רקע ניתן למנוע על ידי דילול נוגדנים יותר או הגדלת מספר שוטף, או לקצר את זמן הדגירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים לחברי Matsunami מעבדה קריאה ביקורתית של כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
