Summary
إدخال الجينات في المصالح في خلية هي طريقة فعالة لتوضيح وظيفتها في الجسم الحي. يصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لtransfecting ثقافة الخلايا الجذعية البشرية / السلائف العصبي (hNSPCs) باستخدام جهاز electroporation Nucleofector التي Amaxa.
Abstract
وقد أدى ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية في الثدييات الأولية ، مثل الخلايا الجذعية البشرية / السلائف العصبي (hNSPCs) ، مع استخداما الموجبة الكواشف ترنسفكأيشن الدهون غالبا في بقاء الخلية الفقراء وذوي الكفاءة ترنسفكأيشن. محدودة أيضا الطرق الميكانيكية الأخرى لإدخال الجين في المصالح ، مثل مدفع الجينات أو microinjection ، من خلال بقاء الخلية الفقراء وانخفاض أعداد خلايا transfected. وقد تم تقييد استخدام استراتيجية يبني الفيروسية لإدخال جينة في الخلايا الخارجية الابتدائي بحلول المبلغ كل من الوقت والعمل المطلوب لإنشاء نواقل الفيروسية ومخاوف تتعلق بالسلامة المحتملة. نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لtransfecting hNSPCs باستخدام جهاز لAmaxa Nucleofector والتكنولوجيا مع معلمات التيار الكهربائي والحلول العازلة على وجه التحديد الأمثل لtransfecting الخلايا الجذعية العصبية. باستخدام هذا البروتوكول ، حققنا الكفاءة ترنسفكأيشن الأولي 35 ٪ ~ ~ و 70 ٪ بعد ترنسفكأيشن مستقرة. بروتوكول يستلزم الجمع بين عدد كبير من hNSPCs مع الحمض النووي ليكون transfected في المنطقة العازلة المناسبة تليها electroporation مع الجهاز Nucleofector.
Protocol
ملاحظة : يرجى الرجوع إلى الإنسان الركض الخلايا الجذعية العصبية المادة ( http://www.jove.com/index/Details.stp؟ID=263 ) والإنسان العصبية العد المادة الخلايا الجذعية ( http://www.jove.com / مؤشر / Details.stp؟ ID = 262 ) لمعرفة كيفية resuspend hNSPCs والعد.
إعداد
- تأكد من أن هناك الكثير من الخلايا المتاحة لترنسفكأيشن (أن عدة ملايين من الخلايا transfected لكل DNA).
- معطف زراعة الأنسجة طبق ، الذي سيتم المصنف الخلايا transfected ، مع 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين الإنسان في الليلة التي سبقت ترنسفكأيشن. الحق قبل البدء في بروتوكول ترنسفكأيشن ، إزالة فبرونيكتين ، شطف الطبق مع برنامج تلفزيوني ، الثقافة والإعلام في مكان الطبق. يترك الطبق في 37 ° C زراعة الأنسجة حاضنة دافئة للوسائل الإعلام. أيضا ، ضع 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة في حاضنة دافئة لمرحلة ما قبل إلى 37 درجة مئوية.
- مكان الحمض النووي (ق) ليكون transfected ، والحل ترنسفكأيشن (من Amaxa) على الجليد.
ترنسفكأيشن
- يغسل عدد محدد من الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني (ونحن عادة استخدام ~ 5 × 106 خلية لكل ترنسفكأيشن). بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (1000 دورة في الدقيقة (~ 200xg) لمدة 5 دقائق) ، وإزالة أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني ، وresuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من الحل ترنسفكأيشن قدمت مع عدة ترنسفكأيشن. تعليق نقل الخلية إلى أنبوب 1.7 مل إيبندورف.
- إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي (~ 50-10 ميكروغرام من الحمض النووي لكل ترنسفكأيشن) الى تعليق الخلية والمزيج بلطف.
- باستخدام Amaxa مصغرة ماصة ، ونقل المزيج خلية الحمض النووي في كفيت ترنسفكأيشن Amaxa. تأكد أن لديك 1 مل من وسائل الاعلام ثقافة ما قبل تحسنت للخطوة التالية. أيضا ، إزالة الطبق الخلية مع وسائل الاعلام من حاضنة الثقافة ووضعه في نسيج الثقافة هود.
- ضع كفيت في Nucleofector ، تدوير عجلة عقارب الساعة ، وحدد برنامج "A - 033". أدخل الصحافة.
- يشار إلى ترنسفكأيشن الناجحة التي قام بها وجود طبقة كثيفة جدا من الفقاعات على رأس الحل في كفيت. إضافة 500 وسائل الإعلام في الحارة ميكرولتر كفيت ، واستخدام Amaxa صغيرة ماصة ، ونقل الخلايا transfected في الطبق مع تحسنت قبل وسائل الإعلام. شطف كفيت مع وسائل الإعلام أكثر دافئ وإضافة إلى شطف الطبق نفسه. مكان الطبق مع الخلايا في زراعة الأنسجة 37 ° C الحاضنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول إجراء ترنسفكأيشن سريع نسبيا وفعالة لhNSPCs. باستخدام هذا الإجراء ، لقد حصلنا على الكفاءة ترنسفكأيشن الأولي 35 ٪ ~. ويمكن استخدام الخلايا transfected بواسطة هذا الإجراء على المدى القصير دراسات (خلايا transfected عابر) أو على المدى الطويل إذا تم استخدام الدراسات عامل التحديد إلى إنشاء ستابلي transfected السكان. لقد ولدت لنا الخلايا التي transfected ستابلي ~ 70 ٪ من الخلايا التعبير عن بروتين خارجية. في hNSPCs transfected عابر ، لاحظنا استمرار التعبير من البروتين الخارجية لأيام 7 ~.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف الدكتور فيليب H. شوارتز من العصبية الوطنية الجذعية البشرية الموارد خلية في مستشفى الأطفال في ليالي ، أورانج كاونتي معهد البحوث لتوفير hNSPC الثقافات.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
