Summary
感兴趣的基因引入细胞，为阐明其在体内的功能强大的方法。这个协议描述一个有效的方法转染人类神经干/前体细胞，使用由Amaxa Nucleofector电设备（hNSPCs）文化。
Abstract
初级哺乳动物的神经细胞，如人类神经干/前体细胞（hNSPCs）常用的阳离子脂质体转染试剂，转染，往往导致不良的细胞活力和转染效率低。其他机械方法引入一个感兴趣的基因，如基因枪或显微注射，也是有限的由差转染细胞的细胞活力和低的数字。利用病毒的结构，引入外源基因的原代细胞的战略受到了制约金额所需的时间和劳动，创建病毒载体和潜在的安全问题。我们在这里描述为转染hNSPCs使用Amaxa Nucleofector设备和技术，专门用于优化转染神经干细胞与电流的参数和缓冲溶液的一步一步的协议。使用此协议，我们已经取得了最初的转染效率〜35％和〜70％的稳定转染后。该协议需要相结合，要在适当的缓冲区Nucleofector设备电转染的DNA的hNSPCs高。
Protocol
注：请参阅的传代人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ）和点票人类神经干细胞的文章（ http://www.jove.com /指数/ Details.stp？ID = 262 ），以了解如何重悬并计数hNSPCs。
制备
- 确保有大量可用于转染的细胞（几百万的每个DNA的细胞转染）。
- 外套的组织培养皿中，融入其中，转染细胞接种10μg/ ml的人纤维连接蛋白转染前的晚上，。前开始转协议，取出的纤维连接蛋白，用PBS漂洗的菜，菜的地方文化传媒。离开菜在37℃组织培养孵化器温暖的媒体。另外，在孵化器中放置1毫升培养基预温至37 ° C。
- 将DNA（S）转染和转染的解决方案（从Amaxa）在冰上。
转
- 洗一个细胞，用PBS（我们通常使用〜5 × 106个细胞，每转）定义的数字。离心（1000转（〜200xg）5分钟）的颗粒细胞，取出尽可能PBS，重悬细胞沉淀在100μL转染试剂盒提供的转染的解决方案。将细胞悬液1.7 mL Eppendorf管。
- 加入细胞悬液5μL的DNA（〜5-10微克每转染DNA），轻轻混匀。
- 使用Amaxa迷你移液器，转移到Amaxa转比色皿的细胞DNA的混合。请确保您有1毫升预热的培养基，为下一步。此外，去除细胞菜文化传媒从孵化器，并放置在组织文化罩。
- 放入试管的Nucleofector，顺时针旋转的车轮，并选择计划的“A - 033”。 按 Enter键。
- 解决在试管上非常密集的气泡层的存在是一个成功的转表示。添加到试管500μL温暖的媒体，并使用Amaxa微型吸管，转移到碟预热媒体转染细胞。清洗比色皿更热烈媒体和添加冲洗，以同样的菜。放置在37℃组织培养箱内培养细胞的菜。
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Discussion
这一协议描述为hNSPCs相对快速，高效的的转染过程。使用此过程中，我们已取得了初始转染效率〜35％。此过程中的转染细胞，可用于短期研究（瞬时转染的细胞）或较长期的研究中，如果选择代理是用来产生一个稳定转染的人口。我们已经产生了稳定转染的细胞在其中〜70％的细胞表达外源蛋白。在瞬时转染hNSPCs，我们所观察到的〜7天的外源蛋白的持续表达。
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Acknowledgments
作者要感谢在儿童医院，奥兰治县提供hNSPC文化研究所的菲利普H ·施瓦茨博士国家人类神经干细胞资源。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
