Summary
היכרות עם גן עניין לתא היא שיטה חזקה הבהרת תפקידה in vivo. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting תרבות של גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs) באמצעות מנגנון electroporation Nucleofector שנעשו על ידי Amaxa.
Abstract
Transfection העיקרי של תאים עצביים יונקים, כגון גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs), עם נפוץ ריאגנטים transfection קטיוני שומנים הביא לעתים קרובות כדאיות התא עניים transfection יעילות נמוכה. שיטות מכאניות אחרות של החדרת גן של עניין, כגון אקדח או גן microinjection, מוגבלים גם על ידי כדאיות התא עניים המספרים הנמוכים של תאים transfected. האסטרטגיה של שימוש בונה ויראלי להציג הגן אקסוגניים לתוך תאים ראשוניים כבר מוגבל על ידי כמות הן של זמן העבודה הנדרש כדי ליצור וקטורים נגיפיים חששות בטיחות פוטנציאליים. אנו מתארים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד עבור transfecting hNSPCs השימוש במכשיר Nucleofector של Amaxa וטכנולוגיה עם פרמטרים זרם חשמלי ופתרונות המאגר מותאם במיוחד עבור transfecting בתאי גזע עצביים. שימוש בפרוטוקול זה, השגנו יעילות transfection הראשונית של 35% ו ~ ~ 70% לאחר transfection יציבה. הפרוטוקול מחייב שילוב של מספר גבוה של hNSPCs עם ה-DNA להיות transfected במאגר המתאים ואחריו electroporation עם המכשיר Nucleofector.
Protocol
הערה: עיין Passaging האדם מאמר בתאי גזע עצביים ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ואת ספירת אדם בתאי גזע עצביים מאמר ( http://www.jove.com / ראשי / Details.stp? ID = 262 ) כדי ללמוד כיצד resuspend ולספור hNSPCs.
הכנה
- ודא כי יש שפע של תאים זמינים transfection (כמה מיליוני תאים עבור כל ה-DNA להיות transfected).
- מעיל רקמה צלחת תרבות, שלתוכו התאים transfected יהיה seeded, עם 10 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין האדם אמש transfection. ממש לפני תחילת פרוטוקול transfection, להסיר את פיברונקטין, לשטוף את המנה עם PBS, מקום ותרבות התקשורת בצלחת. השאירו את המנה ב 37 ° C תרבות רקמות חממה לחמם את התקשורת. כמו כן, מקום 1 מ"ל של התקשורת בתרבות בחממה מראש חמים 37 ° C.
- הנח את ה-DNA (ים) להיות transfected, והפתרון transfection (מ Amaxa), על קרח.
Transfection
- לשטוף מספר מוגדר של תאים עם PBS (אנחנו בדרך כלל להשתמש ~ 5 x 106 תאים לכל transfection). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (1000 סל"ד (~ 200xg) במשך 5 דקות), להסיר כמו PBS הרבה ככל האפשר, resuspend התא גלולה ב 100 μl של הפתרון transfection המסופק עם ערכת transfection. מעבירים את ההשעיה לתא צינור Eppendorf 1.7 מ"ל.
- הוסף 5 μl של ה-DNA (~ 50-10 מיקרוגרם של ה-DNA לכל transfection) כדי ההשעיה תא ומערבבים בעדינות.
- שימוש Amaxa מיני פיפטה, להעביר את התערובת לתוך התא ה-DNA קובט transfection Amaxa. ודא שיש לך 1 מ"ל של טרום חימם בתקשורת תרבות לשלב הבא. כמו כן, להסיר את צלחת תא עם התקשורת בתרבות מן האינקובטור ולמקם אותו למכסה המנוע בתרבית רקמה.
- מניחים את קובט לתוך Nucleofector, לסובב ההגה עם כיוון השעון, ובחר בתוכנית "A-033". לחץ על Enter.
- Transfection מוצלח מותווה על ידי נוכחות של שכבה צפופה מאוד של בועות על גבי פתרון של קובט. הוסף 500 μl מדיה חם לתוך קובט, ושימוש Amaxa מיני פיפטה, העברת תאים transfected לתוך צלחת עם טרום חימם התקשורת. שוטפים את קובט עם התקשורת יותר חמים ומוסיפים את לשטוף את צלחת זהה. מניחים את צלחת עם תאים של 37 ° C תרבות רקמות חממה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר הליך transfection מהיר יחסית ויעיל hNSPCs. באמצעות הליך זה, השגנו יעילות transfection הראשונית של 35% ~. תאים transfected על ידי הליך זה יכול לשמש מחקרים קצרי טווח (תאים transfected transiently) או לטווח ארוך מחקרים אם סוכן מבחר משמש ליצירת אוכלוסיה transfected ביציבות. יש לנו שנוצר בתאי transfected ביציבות שבו ~ 70% מכלל התאים מבטאים את חלבון אקסוגני. ב hNSPCs transfected transiently, ראינו ביטוי המשיכה של חלבון אקסוגני עבור ~ 7 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר ד"ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג' קאונטי מכון המחקר למתן תרבויות hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
