Summary
L'introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l'apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.
Abstract
Trasfezione di cellule primarie neurale dei mammiferi, come umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), con reagenti comunemente usati lipidi cationici transfezione ha spesso portato la vitalità delle cellule poveri e bassa efficienza di trasfezione. Altri metodi meccanici di introdurre un gene di interesse, come ad esempio una pistola gene o microiniezione, sono anche limitato dalla scarsa vitalità delle cellule e basso numero di cellule transfettate. La strategia di usare costrutti virali per introdurre un gene esogeno in cellule primarie è stata limitata sia dalla quantità di tempo e lavoro necessari per creare vettori virali e di potenziali problemi di sicurezza. Descriviamo qui un passo-passo protocollo per la trasfezione hNSPCs utilizzando un dispositivo Nucleofector Amaxa e la tecnologia con parametri elettrici corrente e soluzioni tampone specificamente ottimizzato per trasfezione delle cellule staminali neurali. Usando questo protocollo, abbiamo raggiunto l'efficienza di transfezione iniziale del ~ 35% ~ 70% e dopo trasfezione stabile. Il protocollo prevede che combina un elevato numero di hNSPCs con il DNA per essere transfettate nel buffer appropriato seguito da elettroporazione con il dispositivo Nucleofector.
Protocol
Nota: Fare riferimento all'articolo Passaging neurali Cellule staminali umane ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) e il conteggio umani articolo Neural Stem Cells ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) per imparare a risospendere e contare hNSPCs.
Preparazione
- Assicurarsi che ci sono un sacco di cellule disponibili per la trasfezione (diversi milioni di cellule per ogni DNA da transfettate).
- Cappotto di una cultura di tessuto piatto, in cui le cellule transfettate saranno teste di serie, con 10 mg / ml fibronectina umana la sera prima di trasfezione. A destra prima di avviare il protocollo di trasfezione, rimuovere la fibronectina, lavare il piatto con PBS, luogo della cultura e dei media nel piatto. Lasciare il piatto nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore per riscaldare i media. Inoltre, posto 1 ml di terreni di coltura in incubatrice per pre-riscaldare a 37 ° C.
- Posizionare il DNA (s) di essere trasfettate, e la soluzione di trasfezione (da Amaxa), sul ghiaccio.
Trasfezione
- Lavare un numero definito di cellule con PBS (usiamo di solito ~ 5 x 106 cellule per trasfezione). Agglomerare le cellule per centrifugazione (1000 rpm (~ 200xg) per 5 minuti), togliere il PBS più possibile, e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri della soluzione di trasfezione fornito con il kit di trasfezione. Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf.
- Aggiungere 5 ml di DNA (~ 5-10 mg di DNA per trasfezione) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente.
- Utilizzando il Amaxa mini-pipetta, trasferire la cellula-DNA mix nella cuvetta trasfezione Amaxa. Assicurarsi di avere 1 ml di pre-riscaldato terreni di coltura per il prossimo passo. Inoltre, rimuovere il piatto cella con terreni di coltura dal termostato e posizionarlo nel cappuccio coltura di tessuti.
- Posizionare la cuvetta nella Nucleofector, ruotare la ruota in senso orario, e selezionare il programma "A-033". Premere Invio.
- Un trasfezione di successo è indicato dalla presenza di uno strato molto denso di bolle sulla parte superiore della soluzione nella cuvetta. Aggiungere 500 microlitri mezzi caldo nella cuvetta, e utilizzando il Amaxa mini-pipetta, trasferire le cellule transfettate nel piatto con pre-riscaldato media. Sciacquare la cuvetta con i media più calda e aggiungere il risciacquo per lo stesso piatto. Porre la capsula con le cellule nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore.
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Discussion
Questo protocollo descrive una procedura di trasfezione relativamente rapido ed efficiente per hNSPCs. Utilizzando questa procedura, abbiamo ottenuto l'efficienza di transfezione iniziale del ~ 35%. Cellule transfettate con questa procedura può essere utilizzata per studi a breve termine (cellule trasfettate transitoriamente) o per studi a lungo termine se un agente di selezione viene utilizzato per generare una popolazione stabilmente transfettate. Abbiamo generato cellule trasfettate stabilmente in cui circa il 70% delle cellule esprimono la proteina esogena. In hNSPCs trasfettate transitoriamente, abbiamo osservato l'espressione continuata della proteina esogena per ~ 7 giorni.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini s, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di culture hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
