Summary
Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.
Abstract
Transfecção de células primárias de mamíferos neural, tais como tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), comumente usado com os reagentes de transfecção catiônicas lipídicas resultou muitas vezes na viabilidade celular pobres e eficiência de transfecção baixo. Outros métodos mecânicos de introduzir um gene de interesse, como uma arma gene ou microinjeção, também são limitados pela viabilidade celular pobres e baixos números de células transfectadas. A estratégia de usar construções viral para introduzir um gene exógeno em células primárias tem sido condicionada pela quantidade de tempo e trabalho necessário para criar vetores virais e preocupações de segurança em potencial. Descrevemos aqui um protocolo passo a passo para transfecting hNSPCs utilizando dispositivo Nucleofector Amaxa e tecnologia com os parâmetros elétricos atuais e soluções tampão especificamente otimizados para transfecting células-tronco neurais. Usando este protocolo, conseguimos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35% e ~ 70% após transfecção estável. O protocolo envolve combinando um elevado número de hNSPCs com o DNA para ser transfectadas no buffer apropriada, seguida de eletroporação com o dispositivo Nucleofector.
Protocol
Nota: Consulte o artigo Neural Stem Passaging Humanos Cells ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ea Human Neural Stem Contando artigo Cells ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) para aprender a ressuspender e contar hNSPCs.
Preparação
- Certifique-se que há uma abundância de células disponíveis para transfecção (vários milhões de células para cada DNA a ser transfectadas).
- Revestimento de um prato de cultura de tecidos, no qual as células transfectadas serão distribuídos, com 10 mg / ml fibronectina humana na noite anterior transfecção. Direito antes de iniciar o protocolo de transfecção, remova a fibronectina, lavar o prato com PBS, e media o lugar da cultura no prato. Deixe o prato no 37 ° C a cultura de tecidos incubadora para aquecer a mídia. Além disso, coloque 1 ml de meios de cultura na incubadora para pré-aquecer a 37 ° C.
- Coloque o DNA (s) a ser transfectadas, e solução de transfecção (de Amaxa), sobre o gelo.
Transfecção
- Lavar um número definido de células com PBS (geralmente usamos ~ 5 x 106 células por transfecção). Agregar as células por centrifugação (1000 rpm (~ 200xg) por 5 minutos), retire como PBS tanto quanto possível, e ressuspender o pellet celular em 100 ml da solução de transfecção fornecido com o kit de transfecção. Transferir a suspensão de célula para um tubo eppendorf 1,7 ml.
- Adicionar 5 l do DNA (~ 5-10 mg de DNA por transfecção) para a suspensão de células e misture delicadamente.
- Usando o Amaxa mini-pipeta, transferir a mistura de células-DNA na cuvete transfecção Amaxa. Certifique-se que 1 ml de mídia pré-aquecido a cultura para a próxima etapa. Além disso, remova o prato com meios de cultura de células da incubadora e colocá-la na capa de cultura de tecidos.
- Coloque a cuvete no Nucleofector, gire a roda no sentido horário, e seleccione programa "A-033". Pressione Enter.
- A transfecção de sucesso é indicada pela presença de uma camada muito densa de bolhas no topo da solução na cuvete. Adicionar 500 mL de mídia quente na cuvete, e usando o Amaxa mini-pipeta, transferir as células transfectadas no prato com pré-aquecido mídia. Lavar a cuvete com a mídia mais morna e adicione a água para o mesmo prato. Coloque o prato com as células do tecido 37 ° C a cultura incubadora.
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Discussion
Este protocolo descreve um procedimento de transfecção relativamente rápida e eficiente para hNSPCs. Usando este procedimento, obtivemos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35%. Células transfectadas por este procedimento pode ser usado para estudos de curto prazo (células transfectadas transitoriamente) ou para estudos de longo prazo se um agente de seleção é usado para gerar uma população estável transfectadas. Geramos células transfectadas estavelmente em que ~ 70% das células expressam a proteína exógena. Em hNSPCs transitoriamente transfectadas, temos observado expressão da proteína continuou exógena para a 7 dias.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
