Summary
Bir ilgi bir hücreye gen Tanıtımı in vivo fonksiyonu nedenlerine açıklık için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol Amaxa tarafından yapılan Nucleofector elektroporasyon cihazları kullanırken insan nöral kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) bir kültür transfecting verimli bir yöntem açıklanır.
Abstract
Yaygın olarak kullanılan katyonik lipid transfeksiyon ayıraçları ile insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) gibi birincil memeli sinir hücreleri, Transfeksiyon genellikle kötü hücre canlılığı ve düşük transfeksiyon verimliliği sonuçlandı. Böyle bir gen tabancası veya mikroenjeksiyon gibi ilgi bir gen, tanıtan diğer mekanik yöntemler de kötü hücre canlılığı ve transfekte hücreleri düşük numaraları ile sınırlıdır. Birincil hücre içine dışsal bir gen tanıtmak için viral yapıları kullanarak strateji viral vektörler ve potansiyel güvenlik endişeleri oluşturmak için gerekli zaman ve emek miktarı hem de kısıtlı olmuştur. Biz burada, nöral kök hücreler transfecting için özel olarak optimize edilmiş elektrik akımı parametreleri ve tampon çözeltiler Amaxa Nucleofector cihaz ve teknoloji kullanarak hNSPCs transfecting için bir adım-adım protokolünü açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz, yaklaşık% 35 ilk transfeksiyon verimlilik elde etti ve istikrarlı bir transfeksiyon sonra% 70 ~. Protokol Nucleofector cihaz ile elektroporasyon uygun tampon transfekte DNA ile hNSPCs yüksek sayıda birleştirerek gerektirir.
Protocol
Not: Pasajlanması İnsan Nöral Kök Hücreler makale (bakın http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) ve Sayım İnsan Nöral Kök Hücreler makale ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 hNSPCs tekrar süspansiyon ve saymak nasıl öğrenmek için).
Hazırlık
- Transfeksiyon için kullanılabilir hücreleri bol miktarda (her DNA için birkaç milyon hücreleri transfekte) olduğuna emin olun.
- Transfekte hücreler 10 mcg / ml insan fibronektin transfeksiyon bir gece önce, seribaşı olacak içine Coat doku kültürü tabak,. Sağ transfeksiyon protokolü başlamadan önce, fibronektin kaldırmak, tabak PBS ile durulama ve çanak kültür ortamı. Ortamı ısıtmak için 37 ° C doku kültürü inkübatör çanak bırakın. Ayrıca, önceden sıcak 37 ° C inkübatör 1 ml kültür ortamı
- Transfekte DNA (ler), ve buz üzerinde transfeksiyon çözüm (Amaxa) yerleştirin.
Transfeksiyon
- PBS (genellikle x 106 hücre transfeksiyon başına ~ 5) hücreleri belirli bir sayıda yıkayın. Pelet santrifüjle (1000 rpm 5 dakika boyunca (~ 200xg)) hücreleri tarafından mümkün olduğu kadar çok PBS olarak kaldırmak ve 100 ul transfeksiyon kiti ile sağlanan transfeksiyon çözüm hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu, 1.7 ml Eppendorf tüpüne aktarın.
- Hücre süspansiyonu ul DNA 5 (transfeksiyon ortalama DNA ~ 5-10 mg) ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- Amaxa mini-pipet kullanarak, hücre DNA karışımı Amaxa transfeksiyon küvet içine aktarın. 1 ml, sonraki adım için önceden ısıtılmış kültür ortamı olduğundan emin olun. Ayrıca, inkübatör, hücre çanak kültür ortamı ile kaldırmak ve doku kültürü kaputu yerleştirin.
- Küvet Nucleofector koyun, tekerleği saat yönünde döndürmek ve programı "A-033" i seçin. Enter tuşuna basın.
- Başarılı bir transfeksiyon küvet çözüm üstünde kabarcıklar çok yoğun bir tabakanın varlığı ile gösterilir. Küvet içinde 500 ul sıcak medya ekleyin ve Amaxa mini-pipet kullanarak transfekte hücreler, önceden ısıtılmış medya ile çanak içine aktarın. Küvet daha sıcak bir ortam ile durulayın ve aynı bulaşık durulama ekleyin. 37 ° C doku kültürü inkübatör hücreleri ile çanak yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol hNSPCs için oldukça hızlı ve verimli bir transfeksiyon prosedürü açıklamaktadır. Bu yordamı kullanarak, biz, yaklaşık% 35 ilk transfeksiyon verimlilik elde edilmiştir. Bu yordamı transfekte Hücreler bir seçim aracı stably transfekte nüfus üretmek için kullanılır ise kısa vadeli çalışmalar için (geçici olarak transfekte hücreler) ya da uzun vadeli çalışmalar için kullanılabilir. Biz eksojen protein ifade hücrelerin% 70 ~ hangi stabil transfekte hücreleri oluşturulur. Geçici transfekte hNSPCs, eksojen protein ~ 7 gün boyunca devam ifade gözlemledik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, Çocuk Hastanesi, Orange County hNSPC kültürleri Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynak Dr. Philip H. Schwartz kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
