Summary
Wij rapporteren de ontwikkeling van een negatieve selectie systeem in
Abstract
Entamoeba histolytica is de veroorzaker van amebiasis en infecteert tot 10% van de wereldbevolking. De moleculaire technieken die in staat hebben gesteld de up-en down-regulatie van genexpressie vertrouwen op de transfectie van stabiel blijft plasmiden. Hoewel deze hebben onze kennis van Entamoeba virulentiefactoren, de capaciteit om exogeen DNA te integreren in het genoom, die het mogelijk maken reverse genetics experimenten, zou een belangrijk voordeel zijn in de studie van deze parasiet. De uitdagingen van dit organisme zijn onvermogen om te kiezen voor homologe recombinatie gebeurtenissen en problemen bij het episomale plasmide DNA genezen van getransfecteerde trofozoïeten. De latere resulteert in een hoge achtergrond van exogeen DNA, een groot probleem bij de identificatie van trofozoïeten waarin een bonafide genomische integratie gebeurtenis heeft plaatsgevonden. Wij rapporteren de ontwikkeling van een negatieve selectie systeem dat gebaseerd is op transgene expressie van een gist cytosine en uracil deaminase fosforibosyltransferase Chimera (FCU1) en de selectie met prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). De FCU1 enzym zet niet-toxische 5-FC in giftige 5-fluorouracil en 5-fluoro-5'-monofosfaat. E. histolytica lijnen uitdrukken FCU1 bleken 30 keer gevoeliger voor de prodrug vergelijking met de controlegroep stam te zijn.
Protocol
1. FCU negatieve selectie System in Entamoeba histolytica
- De vector controle lijn (HM1 / pKT3M) en de experimentele lijn (HM1/pKT3M-FCU1) werden gegenereerd door de eerder beschreven technieken 1,2. Zaad van de lijnen onder studie van de voorraad buizen in T-25 kolven en te onderhouden selectie door het toevoegen van geschikte antibioticum (12 ug / ml G418) in TYI-S-33 3 medium. De kolven moet 70-80% samenvloeiende na 16-18 uur van de groei op 37 ° C.
- Bereid een verse voorraad 50 mM oplossing van 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) in warm TYI-S-33 medium. Vortex rigoureus een aantal minuten volledig op te lossen 5-FC. Filter-Steriliseer de stock-oplossing door het door een 0,22 urn filter.
- Oogst trofozoïeten door het plaatsen van de kolven op ijs gedurende 3-5 minuten en het verzamelen van de cellen door centrifugeren bij 200xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in verse TYI medium en tel de cellen.
- Ontwerp van een typisch experiment maakt gebruik van 0,5 x 10 4 cellen per putje van een 48 wells plaat in een eindvolume van 1 ml, of drie herhalingen voor elke test conditie. Bovendien, om te bevorderen fluorescerende metingen, is een aparte plaat gebruikt voor elke stam per tijdstip.
- Zaad 0,5 x 10 4 cellen per well voor elke test 5-FC concentratie, in drievoud. Handhaaf het antibioticum selectie druk in de TYI medium. Voeg nu de benodigde hoeveelheid van 5-FC stockoplossing aanwezig zijn en trofozoïeten aan elk putje.
- Incubeer de platen in een anaërobe zak bij 37 ° C.
2. Bepaling van de Selectie-efficiëntie
- Bereid 2 mg / ml stockoplossing van Cell tracker groene CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Om de werkende oplossing te verdunnen de voorraad 1000-voudige in serum-vrij TYI medium.
- Volledig verwijderen van het medium uit trophozoite cultuur platen en te vervangen door 150 pi serum-vrij TYI met CMFDA. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Verwijder de kleurstof oplossing uit putten en lees de plaat in de Spectramax M2 microplaat Spectrofluorometer. De excitatie golflengte moet worden vastgesteld op 492 nm en de fluorescentie-emissie te lezen bij 517 nm.
- Vergelijk de fluorescentie waarden voor de controle cellen ten opzichte van de test transfectanten.
- Ga door het lezen van de platen op elk tijdsinterval. Gebruik de juiste positieve (TYI alleen) en negatieve (25 ug / ml hygromycine) controle putten in elk bord.
3. Representatieve resultaten
De E. histolytica transfectanten toonde sterke expressie van codon-geoptimaliseerde recombinant FCU1 (figuur 1). Wanneer dit protocol correct wordt nageleefd dit resulteert in selectieve eliminatie van E. histolytica cellen die FCU1 in aanwezigheid van 0,5 mM 5-fluorocytosine. Controle cellen, blijven in tegenstelling tot normaal groeien tot 5 mM concentratie van 5-FC en de samenvloeiing te bereiken tussen 72 en 96 uur (figuur 2-a). De FCU1 die cellen op 48 uur volledig gelyseerd wanneer de behandelde putten worden bekeken onder een microscoop. Deze tonen ook af fluorescentie na kleuring met de vitale kleurstof CMFDA, die wordt gebruikt in kwantitatieve studies waarbij grote aantal monsters (figuur 2-b). Het FCU1/5-FC systeem is een effectieve en krachtige negatieve selectie tool voor E. histolytica trofozoïeten.
Figuur 1. Generatie van E. histolytica HM1 transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker
(A) FCU1 recombinant eiwit werd ontdekt op een western blot met behulp van anti-c Myc antilichaam (bovenste paneel). Zoals verwacht, zou een 42kDa band worden gedetecteerd (aangegeven door een pijl) in de totale lysaat van de FCU transfectanten, maar niet in de vector alleen controle transfectanten. Het onderste paneel toont dezelfde blot onderzocht met anti actine antilichaam als een laad controle. (B) De resultaten van de kwantitatieve real-time PCR met de expressie van specifieke mRNA FCU1 genormaliseerd tot lgl4 te controleren.
Figuur 2. In vitro drug gevoeligheid van E. histolytica transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker
Overlevingscurven van (een) controle transfectanten en (b) FCU1 uitdrukken transfectanten gekweekt in 48-well plaat. De cellen werden gekweekt in aanwezigheid van toenemende concentraties van de prodrug-5-fluorocytosine; overleving van de cel werd gekwantificeerd door CMFDA vlekken op elk tijdsinterval zoals aangegeven op de X-as. De Y-as staat voor fluorescentie-eenheden en is een directe weerspiegeling van de overlevende celpopulatie. Houdt u er rekening mee dat de FCU1 uiten transfectanten significant gevoeligheid toonde bij 0,5 mm prodrug concentratie in vergelijking met de controlegroep. Geen cellen werden waargenomen op 120h tijdstip in deze putten als comvergeleken aan de samenvloeiing groei zien in de bijbehorende controle putten onder de microscoop (gegevens niet getoond). Hygro duidt 25μg / ml hygromycine gebruikt als een negatieve controle.
Discussion
Hoewel er aanzienlijke vooruitgang in de Entamoeba moleculaire biologische tools zijn er geen actuele methoden beschikbaar om te verwijderen of verstoren genen 4. Knockdown van gen-specifieke expressie is bereikt door het gebruik van de hairpin RNA's 5, kleine interfererende RNA 6 en bacterieel uitgedrukt dsRNA 7. Maar deze methoden, terwijl effectief voor de respectieve streefwaarden genen, hebben een aantal beperkingen zoals het gebruik van dure chemicaliën, continue selectie tegen antibiotica en de noodzaak voor constante validatie door de hoge incidentie van terugval die zich in de tijd (Alicia Linford, persoonlijke communicatie) 8.
Elke plasmide kan repliceren in Entamoeba want er is blijkbaar niet een strikte volgorde vereiste voor oorsprong van de DNA-replicatie 9, en dus als getransfecteerd, is het meestal moeilijk om een plasmide te genezen. Dit beperkt het mogelijke gebruik van intacte plasmiden in recombinatie en knockout experimenten. Negatieve selectie markers zijn belangrijke componenten van gen-targeting methodes als ze kunnen worden gebruikt om recombinant subpopulaties te elimineren. We hebben met succes een uitgesproken codon geoptimaliseerd FCU1 gen in Entamoeba histolytica en getest zijn potentieel als een negatief selecteerbare marker. Dit gen fusie werd gebruikt voor zelfmoord gentherapie van menselijke tumorcellen en metaboliseert de prodrug 5-FC in giftige downstream producten, resulterend in remming van RNA en DNA-synthese 10. FCU1 is onlangs gebruikt als een negatief selecteerbare marker in Plasmodium, een ander protozoaire parasiet. Plasmodium berghei cellen die FCU1 bleken bijna 1000 keer meer gevoelig voor de prodrug in vitro en in vivo behandeling met 5-FC doodde meer dan 99,9% van de infecteren recombinant parasieten in de erytrocytaire fase muismodel van malaria 11. E. histolytica cellen die FCU1 toonde slechts een 30-voudige verhoogde gevoeligheid voor de prodrug 5-FC in tegenstelling tot de gevoeligheid waargenomen in P. berghei. Mogelijke redenen hiervoor kan grote pool van nucleotiden in het groeimedium concurreren met de giftige metabolieten worden.
In beide P. berghei en P. falciparum de FCU1 marker is gebruikt in gerichte gendisruptie. studies 11,12. Wij streven ernaar om de Entamoeba genoom met behulp van homologe recombinatie te manipuleren. De validatie van de FCU1/5-FC negatieve selectie systeem is een belangrijke stap in de richting van dit doel.
Disclosures
De productie van deze video werd gesponsord door Sigma Aldrich, Inc, die een aantal van de gebruikte reagentia in dit artikel oplevert.
Acknowledgments
We willen graag Dr Philippe erbs bedanken voor het verstrekken van ons met de volgorde van FCU1 gen. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie AI 26.649.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
