Summary
Nós relatamos o desenvolvimento de um sistema de seleção negativa no
Abstract
Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase e infecta até 10% da população do mundo. As técnicas moleculares que permitiram a cima e para baixo-regulação da expressão gênica dependem da transfecção de plasmídeos mantida de forma estável. Enquanto estes têm aumentado nossa compreensão de fatores de virulência Entamoeba, a capacidade de integrar DNA exógeno no genoma, o que permitiria experimentos de genética inversa, seria uma vantagem significativa no estudo deste parasita. Os desafios apresentados por este organismo incluem a incapacidade para selecionar para eventos de recombinação homóloga e dificuldade para curar DNA plasmídeo epissomal de trofozoítos transfectadas. Os resultados mais tarde, em um fundo elevado de DNA exógeno, um grande problema na identificação de trofozoítos no qual um evento de integração bona fide genômica ocorreu. Nós relatamos o desenvolvimento de um sistema de seleção negativa baseada em expressão transgênica de uma citosina deaminase fermento e uracil fosforribosil transferase quimera (FCU1) seleção e com o pró-fármaco 5-fluorocitosina (5-FC). A enzima converte FCU1 non-toxic 5-FC em tóxicos 5-fluorouracil e 5-fluorouridina-monofosfato-5'. E. linhas histolytica expressar FCU1 foram encontrados para ser 30 vezes mais sensíveis aos pró-fármaco em comparação com a estirpe de controlo.
Protocol
1. FCU Sistema de Seleção Negativa em Entamoeba histolytica
- A linha de controle de vetores (HM1 / pKT3M) ea linha experimental (HM1/pKT3M-FCU1) foram gerados por técnicas descritas anteriormente 1,2. Sementes das linhas em estudo a partir dos tubos de ações em frascos T-25 e manter a seleção, adicionando antibiótico adequado (12 mcg / mL G418) em TYI-S-33 de médio 3. Os frascos devem ser 70-80% confluentes após 16-18 horas de crescimento a 37 ° C.
- Prepare uma solução estoque 50 mM fresco de 5-fluorocitosina (5-FC, Sigma) em meio TYI-S-33 quente. Vortex rigorosamente por vários minutos para dissolver 5-FC completamente. Filtro de esterilizar a solução de ações por passagem através de um filtro de 0,22 mM.
- Trofozoítos colheita, colocando os frascos no gelo por 3-5 minutos e recolher as células por centrifugação a 200xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em meio TYI fresco e contar as células.
- Projeto de um experimento típico usa 0,5 x 10 4 células por poço de uma placa de 48 bem em um volume final de 1 mL; e repete em triplicado para cada condição de teste. Além disso, para facilitar as medições fluorescente, um prato separado é usado para cada cepa por ponto de tempo.
- Sementes 0,5 x 10 4 células por poço para cada teste 5-FC concentração, em triplicata. Manter a pressão de seleção de antibióticos no meio TYI. Agora adicione a quantidade necessária de 5-FC solução estoque e trofozoítos a cada poço.
- Incubar as placas em um saco anaeróbica a 37 ° C.
2. Determinação da eficiência da seleção
- Prepare 2 mg / mL solução estoque de celular rastreador verde CMFDA (Invitrogen) em DMSO. Para fazer a solução de trabalho diluir o estoque 1.000 vezes em meio livre de soro TYI.
- Remova o meio completamente de placas de cultura trofozoíto e substituir com 150 mL CMFDA TYI sem soro contendo. Continue incubação a 37 ° C por 1 hora.
- Remover a solução corante de poços e ler a placa na espectrofluorímetro Spectramax microplaca M2. O comprimento de onda de excitação deve ser fixado em 492 nm ea emissão de fluorescência lida em 517 nm.
- Compare os valores de fluorescência para as células controle versus o transfectants teste.
- Continue a ler as placas em cada intervalo de tempo. Uso positivo apropriado (TYI só) e negativo (25 mcg / mL higromicina) poços de controlo em cada prato.
3. Resultados representante
O E. transfectants histolytica mostrou expressão robusta de códon otimizado FCU1 recombinante (Figura 1). Quando este protocolo é seguido corretamente, resulta na eliminação seletiva de E. histolytica células expressando FCU1 na presença de 0,5 mM 5-fluorocitosina. Células controle, em contraste continuar a crescer normalmente em até 5 mM de concentração de 5-FC e chegar a confluência entre 72 e 96 horas (Figura 2-a). O FCU1 células que carregam em 48 horas são completamente lisadas quando os poços tratados são vistos sob um microscópio. Estas também mostram diminuição da fluorescência quando corados com o corante vital CMFDA, que é usado em estudos quantitativos que envolvem grande número de amostras (figura 2-b). O sistema FCU1/5-FC é uma ferramenta eficaz e poderoso de seleção negativa para E. histolytica trofozoítos.
Figura 1. Geração de E. histolytica HM1 transfectants expressar marcador selecionável negativo
(A) FCU1 proteína recombinante foi detectada em um western blot utilizando anticorpo anti-c Myc (painel superior). Como esperado, uma banda de 42kDa pode ser detectado (indicado por uma seta) no lisado total do transfectants FCU, mas não no vetor sozinho transfectants controle. O painel inferior mostra o mesmo sondado blot com anticorpo anti actina como controle de carga. (B) Resultado do quantitativo PCR em tempo real mostrando a expressão de mRNA específicos FCU1 normalizado para lgl4 controle.
Figura 2. Drogas sensibilidade in vitro de E. transfectants histolytica expressar marcador selecionável negativo
Curvas de sobrevivência de transfectants (a) e controle (b) transfectants FCU1 expressar cultivadas em 48 poços da placa. As células foram cultivadas na presença de concentrações crescentes do pró-fármaco-5-fluorocitosina; sobrevivência celular foi quantificada através da coloração CMFDA em cada intervalo de tempo conforme indicado no eixo X. O eixo Y representa unidades de fluorescência e é um reflexo direto da população de células sobreviventes. Por favor, note que o FCU1 transfectants expressar mostrou sensibilidade significativa na concentração de 0,5 mM pró-fármaco em comparação com o controle. Nenhuma célula foi observada no ponto de tempo 120h nestes poços como comcomparação com o crescimento confluente visto nos poços de controle correspondente ao microscópio (dados não mostrados). Higrômetro denota 25μg / mL higromicina usado como um controle negativo.
Discussion
Embora tenha havido avanços substanciais na Entamoeba molecular ferramentas biológicas não existem métodos atuais disponíveis para eliminar ou interromper genes 4. Knockdown da expressão do gene específico foi alcançado através da utilização de RNAs hairpin 5, pequena interferência RNA 6 e bactérias expressa dsRNA 7. No entanto, estes métodos enquanto eficaz para os genes-alvo respectivos, várias limitações, incluindo o uso de produtos químicos caros, a seleção contínua contra os antibióticos ea necessidade de validação constante devido à alta incidência de reversão que ocorre ao longo do tempo (Alicia Linford, comunicação pessoal) 8.
Qualquer plasmídeo pode replicar em Entamoeba como não há, aparentemente, uma exigência estrita seqüência de origens de replicação do DNA 9, e assim uma vez transfectadas, que normalmente é difícil de curar um plasmídeo. Isso limita a possibilidade de utilização de plasmídeos intactos em experimentos knockout recombinação e gene. Marcadores de seleção negativa são componentes-chave de gene targeting métodos como eles podem ser usados para eliminar subpopulações recombinante. Temos expressa com sucesso um códon otimizado FCU1 gene em Entamoeba histolytica e testado o seu potencial como um marcador negativo selecionáveis. Este gene de fusão tem sido utilizado para a terapia de gene do suicídio de células tumorais humanas e metaboliza o pró-fármaco 5-FC em tóxicos produtos a jusante, resultando em inibição da RNA e síntese de DNA 10. FCU1 foi recentemente utilizado como um marcador negativo selecionável em Plasmodium, um outro protozoário. Células Plasmodium berghei expressar FCU1 foram encontrados para ser quase 1000 vezes mais sensíveis ao pró-fármaco in vitro e in vivo do tratamento com 5-FC matou mais de 99,9% do infectando parasitas recombinantes no modelo do rato eritrocítica estágio de malária 11. E. histolytica células expressando FCU1 mostrou apenas uma sensibilidade 30 vezes maior para o pró-fármaco 5-FC, em contraste com a sensibilidade observada em P. berghei. Possíveis razões para isso poderia ser grande pool de nucleotídeos disponível no meio de crescimento competindo com os metabólitos tóxicos.
Em ambos os P. berghei e P. falciparum marcador FCU1 tem sido utilizado na interrupção do gene alvo. estudos 11,12. Nosso objetivo é manipular o genoma Entamoeba usando recombinação homóloga. A validação do sistema de seleção FCU1/5-FC negativos é um passo importante para este objectivo.
Disclosures
A produção deste vídeo foi patrocinado pela Sigma Aldrich, Inc, que produz alguns dos reagentes utilizados neste artigo.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Erbs Dr. Philippe por nos fornecer a seqüência de FCU1 gene. Este trabalho foi financiado pelo NIH AI 26649 conceder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
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