Summary
Vi rapporterar utvecklingen av ett negativt urval system
Abstract
Entamoeba histolytica är smittämnen av amebiasis och infekterar upp till 10% av världens befolkning. Den molekylära tekniker som har gjort det möjligt för upp-och nedreglering av genuttryck lita på transfektion av stabilt kvar plasmider. Även om dessa har ökat vår förståelse av Entamoeba virulensfaktorer, till kapaciteten integrera exogena DNA i arvsmassan, vilket skulle ge omvänd genetik experiment, skulle vara en betydande fördel i studiet av denna parasit. De utmaningar som denna organism inkluderar oförmåga att välja för homolog rekombination händelser och svårigheter att bota episomal plasmid DNA från transfekterade trophozoites. Det senare resulterar i en hög bakgrund av exogena DNA, ett stort problem i identifieringen av trophozoites som en bona fide genomisk integrering händelse har inträffat. Vi rapporterar utvecklingen av ett negativt urval baserat på transgena uttryck för en jäst cytosin deaminas och uracil fosforibosyl transferas chimär (FCU1) och urval med prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). Den FCU1 enzym omvandlar giftfria 5-FC till giftiga 5-fluorouracil och 5-fluorouridin-5'-monofosfat. E. histolytica som uttrycker FCU1 befanns vara 30 gånger mer känsliga för prodrug jämfört med kontrollgruppen påfrestningar.
Protocol
1. FCU negativt urval System i Entamoeba histolytica
- Den vektorstyrning linjen (HM1 / pKT3M) och den experimentella linjen (HM1/pKT3M-FCU1) genererades av tidigare beskrivna metoder 1,2. Seed de linjer som studien från beståndet rören i T-25 kannor och underhålla val genom att lägga till lämplig antibiotikabehandling (12 mikrogram / ml G418) i TYI-S-33 3 medium. Kolvarna ska vara 70-80% konfluenta efter 16-18 timmars tillväxt vid 37 ° C.
- Förbered en ny 50 mM stamlösning av 5-Fluorocytosine (5-FC, Sigma) i varmt TYI-S-33 medium. Vortex noggrant under flera minuter att lösa upp 5-FC helt. Filter-sterilisera stamlösning genom passering genom ett 0,22 ìm filter.
- Harvest trophozoites genom att placera flaskor på is i 3-5 minuter och samla cellerna genom centrifugering vid 200xg i 5 minuter i rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i färskt TYI medium och räkna cellerna.
- Design av ett typiskt experiment använder 0,5 x 10 4 celler per brunn på en 48 brunnar i en slutlig volym på 1 ml, och upprepar tre exemplar för varje test skick. Förutom att underlätta fluorescerande mätningar, är en separat plåt som används för varje stam per tidpunkt.
- Seed 0,5 x 10 4 celler per brunn för varje test-5-FC koncentration i tre exemplar. Bibehåll antibiotika selektionstryck på TYI mediet. Lägg nu till den önskade mängden 5-FC stamlösning och trophozoites i varje brunn.
- Inkubera plattorna i en anaerob påse vid 37 ° C.
2. Fastställande av Val Effektivitet
- Förbered 2 mg / ml stamlösning för cell-tracker grön CMFDA (Invitrogen) i DMSO. För att göra brukslösning späda beståndet 1000-faldigt i serum-fri TYI medium.
- Ta bort mediet helt från trophozoite odlingsplattor och ersätta med 150 mikroliter serumfritt TYI innehåller CMFDA. Fortsätt inkubation vid 37 ° C under 1 timme.
- Ta bort färgen lösningen från brunnar och läsa plattan i Spectramax M2 mikroplattan spectrofluorometer. Den excitationsvåglängden bör sättas till 492 nm och fluorescens utsläpp läsa vid 517 nm.
- Jämför fluorescens värden för kontroll cellerna kontra testet transfectants.
- Fortsätt att läsa av plattorna vid varje tidsintervall. Använd lämpliga positiva (TYI endast) och negativa (25 mikrogram / ml hygromycin) kontrollbrunnarna på varje platta.
3. Representativa resultat
E. histolytica transfectants visade robust uttryck för kodon optimerade rekombinant FCU1 (Figur 1). när protokollet följs korrekt det leder till selektiv eliminering av E. histolytica celler som uttrycker FCU1 i närvaro av 0,5 mm 5-fluorocytosine. Kontroll celler, i motsats fortsätter att växa normalt med upp till 5 mM koncentration av 5-FC och nå sammanflödet mellan 72 och 96 timmar (Figur 2-A). Den FCU1 transporterar celler vid 48 timmar är helt lyseras när den behandlade brunnar ses under ett mikroskop. Dessa visar också minskat fluorescens när färgas med den vitala färgämnet CMFDA, som används i kvantitativa studier med stort antal prover (figur 2-B). Det FCU1/5-FC Systemet är ett effektivt och kraftfullt negativt urval verktyg för E. histolytica trophozoites.
Figur 1. Generering av E. histolytica HM1 transfectants uttrycka negativa markör
(A) FCU1 rekombinant protein upptäcktes på en Western Blot med anti-C-Myc antikropp (övre panelen). Som väntat kunde en 42kDa band detekteras (visas med en pil) i den totala lysat från FCU transfectants men inte i vektor ensam kontroll transfectants. Den nedre panelen visar samma blot sonderade med anti aktin antikropp som en belastning kontroll. (B) resultaten av den kvantitativa realtid PCR visar uttryck för FCU1 specifika mRNA normaliseras till lgl4 kontroll.
Figur 2. In vitro drog känslighet E. histolytica transfectants uttrycka negativa markör
Överlevnadskurvorna av (a) kontroll transfectants och (b) FCU1 uttrycka transfectants odlas i 48-brunnar. Cellerna odlades i närvaro av stigande koncentration av prodrug-5-fluorocytosine, cellöverlevnad kvantifierades genom CMFDA färgning vid varje tidsintervall som betecknas på X-axeln. Y-axeln visar fluorescens enheter och är en direkt återspegling av de överlevande cellpopulation. Observera att FCU1 uttrycka transfectants visade signifikant känslighet vid 0.5mm prodrug koncentrationen jämfört med kontrollgruppen. Inga celler observerades vid 120h tidpunkt i dessa brunnar som comfört med konfluenta tillväxten ses i motsvarande kontrollbrunnarna under mikroskop (data visas inte). Hygro betecknar 25μg / ml hygromycin användas som negativ kontroll.
Discussion
Även om det har gjorts betydande framsteg inom Entamoeba molekylärbiologiska verktyg Det finns inga aktuella metoder tillgängliga för att ta bort eller störa gener 4. ÖVERVÄLDIGANDE av genen specifikt uttryck har uppnåtts genom att använda hårnålen RNA 5, små störande RNA 6 och bacterially uttryckt dsRNA 7. Men dessa metoder medan effektiva för respektive mål gener har flera begränsningar, inklusive användningen av dyra kemikalier, kontinuerliga urval mot antibiotika och behovet av ständig validering på grund av den höga förekomsten av reversion som inträffar över tiden (Alicia Linford, personlig kommunikation) 8.
Alla plasmiden kan replikera i Entamoeba eftersom det uppenbarligen inte en strikt sekvens krav på ursprung av DNA replikation 9, och så när transfekterade, det oftast är svårt att bota en plasmid. Detta begränsar eventuell användning av intakt plasmider i rekombination och gen-knockout experiment. Negativa markörerna är viktiga komponenter för riktad genmodifiering metoder som de kan användas för att eliminera rekombinant subpopulationer. Vi har framgångsrikt uttryckt en kodon optimerad FCU1 gen i Entamoeba histolytica och testat dess potential som en negativ markör. Denna gen fusion har använts för självmord genterapi på mänskliga tumörceller och metaboliserar prodrug 5-FC in giftiga produkter i senare led vilket resulterar i hämning av RNA-och DNA-syntes 10. FCU1 har nyligen använts som en negativ markör i Plasmodium, en annan protozo parasit. Plasmodium berghei celler som uttrycker FCU1 befanns vara nästan 1000 gånger mer känsliga för prodrug in vitro och in vivo-behandling med 5-FC dödade över 99,9% av infektera rekombinant parasiter i erytrocyt-stegs musmodell av malaria 11. E. histolytica celler som uttrycker FCU1 visade bara en 30-faldig ökad känslighet för prodrug 5-FC i kontrast till den känslighet som observerats i P. berghei. Möjliga orsaker till detta kan vara stor pool av nukleotider som finns i tillväxten mediet konkurrerar med de toxiska metaboliter.
I båda P. berghei och P. falciparum den FCU1 markör har använts i riktade genen störningar. studier 11,12. Vi strävar efter att manipulera Entamoeba genomet med hjälp av homolog rekombination. Valideringen av FCU1/5-FC negativt urval är ett viktigt steg mot detta mål.
Disclosures
Produktionen av denna video var sponsrad av Sigma-Aldrich, Inc., som producerar några av de reagenser som används i denna artikel.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Philippe Erbs för att förse oss med den sekvens av FCU1 genen. Detta arbete stöddes av NIH bidrag AI 26.649.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
