Summary
Biz olumsuz bir seçim sisteminin gelişme raporu
Abstract
Entamoeba histolytica amebiyazis etkeni ve dünya nüfusunun% 10 kadar bozar. Gen ekspresyonu yukarı ve aşağı düzenleme etkin moleküler teknikler stabil bir şekilde devam plazmid transfeksiyon güveniyor. Bu Entamoeba virülans faktörleri anlayışımız artış varken, kapasite eksojen DNA genomu içine ters genetik deneyler, bu parazitin çalışmada önemli bir avantaj olacaktır sağlayacak entegre etmek. Bu organizma tarafından sunulan zorluklar homolog rekombinasyon olayları ve transfekte trofozoitleri episomal plazmid DNA tedavi zorluk seçmek için yetersizlik içermektedir. Eksojen DNA, iyi niyetli bir genomik entegrasyon olay meydana geldi trofozoitleri belirlenmesi önemli bir sorun yüksek bir arka planda daha sonra sonuçlanır. Biz olumsuz bir seçim sistemi, bir maya sitozin deaminaz ve urasil prodrogu 5-florositozin (5-FC) fosforibozil transferaz Chimera (FCU1) ve seçim transgenik ifade dayalı gelişme raporu. FCU1 enzim toksik 5-fluorourasil ve 5-fluorouridin-5'-monofosfat E. toksik olmayan, 5-FC dönüştürür FCU1 ifade histolytica hatları 30 kat prodrogu kontrol suşu göre daha duyarlı olduğu tespit edildi.
Protocol
1. Entamoeba histolytica FCU Negatif Seçim Sistemi
- Vektör kontrol hattı (HM1 / pKT3M) ve deneysel hattı (HM1/pKT3M-FCU1), daha önce açıklanan teknikler 1,2 üretildi . Tohum T-25 ölçülü balona stok tüpleri çalışma altında hatları ve TYI-S-33, 3 orta uygun antibiyotik (12 mg / ml G418) ekleyerek seçimi korumak . Matara 37 büyüme 16-18 saat sonra% 70-80 konfluent olmalıdır ° C
- Sıcak TYI-S-33 orta, 5-florositozin (5-FC, Sigma) taze bir 50mm stok solüsyonu hazırlayın. Vortex titizlikle birkaç dakika için tamamen çözmek için 5-FC. Filtre sterilize filtresi 0.22 mikron geçirilerek stok solüsyonu.
- 3-5 dakika buz üzerinde şişeler yerleştirerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200xg santrifüj hücreleri toplamak Hasat trofozoitleri. Taze TYI orta pelletini tekrar ve hücreleri saymak.
- Tipik bir deney tasarımı, son hacim 1 ml 48 plaka başına 0.5 x 10 4 hücreleri kullanır; ve her bir test durumu için üç nüsha tekrarlar . Buna ek olarak, floresan ölçümleri kolaylaştırmak için, her zaman noktası başına suşu için ayrı bir plaka kullanılır.
- Her test 5-FC, konsantrasyon, üç nüsha halinde de her Tohum 0.5 x 10 4 hücreler. TYI orta antibiyotik seçimi basınç koruyun. Şimdi 5-FC stok solüsyonu ve her kuyuya trofozoitleri gereken miktarda ekleyebilirsiniz.
- 37, anaerobik bir torba içinde tabak inkübe ° C
2. Seçim Verimliliğinin Belirlenmesi
- 2 mg / ml DMSO Hücre tracker yeşil CMFDA (Invitrogen) stok solüsyonu hazırlayın. Çalışma çözeltisi, stok serum serbest TYI ortamda 1000 kat sulandırmak yapmak için.
- Orta trophozoite kültür plakaları tamamen kaldırın ve 150 mcL serum serbest TYI içeren CMFDA ile değiştirin. Devam az 37 inkübasyon ° C 1 saat.
- Kuyulardan boya çözüm çıkarın ve SPECTRAmax M2 mikroplaka spectrofluorometer plaka okuma. Dalgaboyu 492 nm dalga boyunda ve 517 nm okuma floresans emisyon olmalıdır.
- Test transfektanları karşı kontrol hücreleri için floresan değerleri karşılaştırın.
- Her bir zaman aralığı plakaları okumaya devam edin. Her plaka uygun pozitif (TYI sadece) ve negatif (25 mg / ml hygromycin) kontrol kuyuları kullanın.
3. Temsilcisi Sonuçlar
E. histolytica transfektanları kodon optimize edilmiş rekombinant FCU1 (Şekil 1) sağlam bir ifade gösterdi. Bu protokol E. seçici eleme sonuçları doğru takip edildiğinde 0.5 mM 5-florositozin varlığı FCU1 ifade histolytica hücreleri. Kontrol hücreleri, aksine 5-FC, 5 mM konsantrasyonu normalde kadar büyüyebilir ve 72 ve 96 saatleri arasında izdiham ulaşmak devam (Şekil 2-a). Tedavi edilen kuyuların bir mikroskop altında incelendi 48 saat FCU1 taşıyan hücreleri tamamen parçalanmış. Bunlar da örnekleri çok sayıda (Şekil 2-b) içeren kantitatif çalışmalarda kullanılan hayati, boya CMFDA ile boyanarak floresan azalma gösterir. FCU1/5-FC sistemi E. için etkili ve güçlü bir negatif seçim aracı histolytica trofozoitleri.
Şekil 1. E. Üretimi negatif seçilebilir işaretleyici ifade histolytica HM1 transfektanları
(A) FCU1 rekombinant protein, anti-c Myc antikor (üst panel) kullanarak bir western blot tespit edildi . Beklendiği gibi, bir 42kDa bant değil sadece vektör kontrolü transfektanları FCU transfektanlarından toplam lizat (bir ok ile gösterilen) tespit edilebilir. Alt panel aynı leke yükleme kontrolü gibi anti aktin antikor probed gösterir. (B) kantitatif gerçek zamanlı PCR Sonuçları lgl4 kontrol etmek için normalize FCU1 spesifik mRNA ifadesi gösteriyor.
E. Şekil 2 in vitro ilaç duyarlılığı negatif seçilebilir işaretleyici ifade histolytica transfektanları
(A) kontrol transfektanları ve (b) FCU1 ifade transfektanları 48 plaka kültür sağkalım eğrileri. Hücreleri artan konsantrasyonlarda varlığı yetiştiği prodrogu-5-florositozin; X-ekseni üzerinde gösterilir hücre sağkalım CMFDA boyama ile her bir zaman aralığı belirlendi. Y ekseni floresan birimleri temsil eder ve hücrenin hayatta kalan nüfusun doğrudan bir yansımasıdır. FCU1 ifade transfektanları 0.5mm prodrogu konsantrasyon, kontrol ile karşılaştırıldığında önemli bir duyarlılık gösterdiğini dikkat ediniz. Hücreleri com bu kuyulardan 120h zaman noktasında gözlendiilgili kontrol kuyuları (veriler gösterilmemiştir) mikroskop altında görülen konfluent büyüme için hazırlandık. Higro negatif kontrol olarak kullanılan 25μg / ml hygromycin gösterir.
Discussion
Entamoeba moleküler biyoloji araçları önemli gelişmeler olmasına rağmen genler 4 silmek veya bozmak için hiçbir geçerli yöntemleri vardır. Gen belirli ifade demonte küçük saç tokası RNA'lar RNA 6 müdahale 5, kullanımı sağlanır ve bakteriyel ifade dsRNA 7 olmuştur. Ilgili hedef genlerin etkili Ancak bu yöntemler, pahalı kimyasalların, antibiyotiklere karşı sürekli seçimi ve zaman içinde meydana gelen reversion yüksek insidansı (Alicia Linford, kişisel iletişim) 8 nedeniyle sürekli doğrulama için ihtiyaç kullanımı da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar var .
DNA replikasyonu 9 kökeni için sıraya gereksinimi görünüşte yok gibi herhangi bir plazmid Entamoeba çoğaltmak, böylece bir kez transfekte, genellikle plazmid tedavi etmek zordur. Bu rekombinasyon ve gen nakavt deneylerde sağlam plazmid olası kullanımını sınırlar. Negatif seçim işaretleri rekombinant alt popülasyonlar ortadan kaldırmak için kullanılabildiği gibi yöntemler hedef geninin anahtar bileşenleri. Biz başarılı bir kodon ifade Entamoeba histolytica FCU1 gen optimize edilmiş ve potansiyel olumsuz seçilebilir marker olarak test edilmiştir. Bu gen füzyon, insan tümör hücreleri intihar gen terapisi için kullanılan ve RNA ve DNA sentezi 10 inhibisyonu sonucu toksik aşağı ürünler haline prodrogu 5-FC metabolize olmuştur . FCU1 son zamanlarda, başka bir protozoon parazit Plasmodium olumsuz bir seçilebilir marker olarak kullanılır olmuştur. FCU1 ifade Plasmodium berghei hücreleri 5-FC ile in vitro ve in vivo tedavisinde prodrogu yaklaşık 1000 kat daha duyarlı olduğu tespit edildi,% 99.9 'u öldürdü 11 sıtma eritrosit aşamalı bir fare modelinde rekombinant parazitlerin bulaşmasını E. FCU1 ifade histolytica hücreleri P. gözlenen hassasiyeti aksine prodrogu 5-FC, sadece 30 kat artmış duyarlılık gösterdi berghei. Bunun için olası nedenleri toksik metabolitleri ile rekabet büyüme orta nükleotidlerin büyük havuz olabilir.
P. hem berghei ve P. falciparum FCU1 işaretleyici hedef gen bozulması kullanılmıştır. çalışmalar 11,12. Biz homolog rekombinasyon kullanarak Entamoeba genom işlemek için hedefliyoruz. FCU1/5-FC negatif seçim sistemi doğrulama, bu amaca yönelik önemli bir adım.
Disclosures
Bu video üretimi Bu makalede kullanılan bazı reaktifler üreten Sigma Aldrich, Inc tarafından sponsor oldu.
Acknowledgments
Biz Dr. Philippe Erbs FCU1 gen dizisi ile sunduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe AI 26.649 tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
