Summary
Новый подход, который позволяет с высокой разрешающей анализ взаимодействия раковых клеток с экзогенными гиалуроновой кислоты (ГК) описывается. Рисунком поверхности изготавливаются путем объединения карбодиимида химии и микроконтактной печати.
Abstract
Вторжение рака и прогрессии предполагает подвижных фенотип клетки, которая находится под комплексное регулирование факторами роста / цитокинов и внеклеточного матрикса (ECM) компонентов внутри опухоли микроокружения. Гиалуроновая кислота (ГК) является одним из стромальных компонентов ECM, которые, как известно, способствовать прогрессии опухоли путем расширения вторжения, роста и ангиогенеза 1. Взаимодействие HA с поверхности клетки рецептора CD44 вызывает сигнальных событий, которые способствуют рост опухолевых клеток, выживание, и миграция, тем самым увеличивая метастазирования 2-3. ГК анионные, nonsulfated гликозаминогликана состоят из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и DN-ацетилглюкозамина. Благодаря наличию карбоксильных и гидроксильных групп на повторяющиеся единицы дисахарид, родной HA в основном гидрофильные и поддается химической модификации, которые вводят сульфат группы для photoreative иммобилизации 4-5. Предыдущие исследования с участием immobilizations ГК на поверхности используют bioresistant поведения ГК и ее производных сульфатированных для контроля клеточной адгезии на поверхности 6-7. В этих исследованиях клеточной адгезии преимущественно происходит на не-HA регионах узорные.
Для анализа межклеточных взаимодействий с экзогенными HA, мы разработали узорной функциональными поверхностями, которые позволяют изучать и управляемых с высоким разрешением визуализации раковых клеток взаимодействия с ГК. Мы использовали микроконтактной печати (ОГП), чтобы определить дискретные узорной регионами ГК на стеклянных поверхностях. "Привязывать" подход, который применяется карбодиимида связи химии для иммобилизации HA было использовано 8. Стекло поверхности были напечатаны с микроконтактной аминосиланом и реагирует с HA решения оптимизированы отношения EDC и NHS чтобы HA иммобилизации в узорной массивов. Включение карбодиимида химии с МКП включен иммобилизации HA в определенных регионах, создание поверхностей, пригодных для применения в пробирке. Оба толстой кишки раковые клетки и клетки рака молочной железы неявно взаимодействует с поверхностями HA micropatterned. Адгезии раковых клеток происходит в течение 24 часов с распространением на 48 часов. Использование HA micropatterned поверхностей, мы показали, что сцепление раковых клеток происходит через CD44 рецептором HA. Кроме того, HA узорной поверхности были совместимы с сканирующей электронной микроскопии (SEM) и позволил высоким разрешением рака выступы ячейки клея и распространения на модели HA анализировать подвижность раковых клеток от экзогенных HA.
Protocol
1. Стандартный фотолитографии для изготовления Stamp Micropatterned
- Промыть новых кремниевой пластины с этанолом и сухой с потоком воздуха. Используйте пинцет для обработки пластин и предотвращения дефектов поверхности в течение всего процесса.
- Передача пластины вращаться нанесения покрытия и покрытия поверхности пластины с SU-2025 отрицательное фоторезиста. Обложка не менее 80% от пластин с фоторезистом. Спиновые пальто в течение 10 секунд на 600rpm, а затем 30 секунд при 3000 оборотов в минуту. Из-за фоточувствительность фоторезиста, выключите комнате свет с этой точки вперед.
- Передача фоторезиста покрытые кремниевой пластины на плитке для «мягких-печь" при 95 ° С в течение 3 минут. Удалить из горячей плиты и позволяет 1 минуты, чтобы охладиться.
- Место сборных маску с желаемым рисунком на верхней части фоторезиста покрытые кремниевой пластины и подвергать воздействию ультрафиолетового (УФ) излучения (350-450 нм) в течение 20 секунд.
- Передача кремниевой пластины с горячей плитой для "жестких-печь" при 110 ° С в течение 6 минут.
- Включите фары и удалить пластину из горячих пластины. Отдельные модели должны быть видны в этой точке.
- Тщательно промойте кремниевой пластины с SU-8 фоторезиста разработчика. После 3 полоскания с разработчиком решение, промыть этанола. Если какой-либо белый осадок присутствует, повторите промыть фоторезиста решение разработчиков, или просто погрузиться в пластине разработчик решений в течение 2 минут и продолжить снова с этанолом полоскания. Промыть водой и просушите.
- Смешайте полидиметилсилоксан (PDMS) решение эластомера и отвердителя в 10:01 весу. Центрифуга на 900rpm в течение 5 мин для удаления пузырьков воздуха.
- Место узорной пластин в чашке Петри и залить PDMS на кремниевой пластине. Если Есть пузыри настоящее место в desicator и вакуумные на пару минут, пока пузырьки исчезают.
- Cure ночь при комнатной температуре (RT) с образованием дополнительных штамп эластомерных. Если PDMS не полностью вылечены после 12 часов, поставить в духовку при температуре 60 ° С в течение 30 минут.
- Осторожно снимите PDMS от пластины кремния. Используйте лезвию бритвы, чтобы сократить штампа нужного размера. Разрушать ультразвуком в этаноле в течение 15 минут. Вафли могут быть использованы несколько раз, чтобы создать новые марки эластомерных.
2. HA Micropatterning
- Плазменные чистой стеклах в течение 5 минут. Поместите все слайды в камере и вакуум в течение 5 минут. Тогда позвольте низкий приток кислорода для входа камеры. Включите плазменный очиститель на 5 минут. Удалить из чистой плазмы и место в чашке Петри использованием щипцов.
- Во время плазменной очистки, разрушать ультразвуком PDMS марки в этаноле в течение 15 минут.
- Подготовка свежий 3% об. / раствор 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) в 95% об. / этанол в 15 мл центрифужную пробирку. Разрешить реагировать в течение 5 минут при комнатной температуре с образованием силанольных.
- Место PDMS штамп шаблону на спину нанесения покрытий патрона и крышка узорчатой поверхности раствором APTMS. Spincoat на 3500rpm в течение 30 секунд. Не прикасайтесь к поверхности штампа, только стороны штамп PDMS.
- Передача APTMS решение плазмы очищается стеклянных поверхностей: установить марку вниз на одном конце узорные стороны и мягко скользят нажатием PDMS так что она полностью в контакте с поверхностью стекла в течение 1 минуты.
- Удалить PDMS штамп мягко, и позволяют узорчатое стекло слайд для инкубации в РТ на 30 минут. Промыть узорной поверхности этанолом и высохнуть на воздухе. Разрушать ультразвуком PDMS штамп в течение 15 минут, чтобы удалить лишнюю APTMS.
- Тепло поверхностей в духовке или на плитке в течение 1 часа при температуре 115 ° C. Полоскание с этанолом и сухим воздухом.
- Подготовка свежих полиэтиленгликоля (PEG)-силана решение от 20% об. / 2 - [метокси (polyethyleneoxy) пропил] trimethoxysilane в толуоле. Это будет служить без клея область вокруг узоров.
- Передача узорчатое стекло слайд в стеклянном блюде Петри и инкубировать в ПЭГ-силана решение в течение 45 минут при 75 ° С на горячей плите. Промыть толуол, вода и сухой воздух.
- Стерилизовать в течение 1 часа с помощью УФ бактерицидные облучения в биологической кабинета безопасности. Действовать в кабинете биологической безопасности с этого момента для поддержания стерильности.
- Подготовка водного стерильного раствора HA.
10 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC)
5 мм N-гидроксисукцинимида
50 мкг / мл меченных флуоресцеином HA - Применить HA решение субстратов узорчатое стекло в стерильных условиях и в защищенном от света. Рисунком поверхности должны быть в покое на 16-24 часов.
- Аспирируйте от HA решение, мыть с фосфатным буферным раствором (PBS), и покрывают поверхность с 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS в течение 1 часа. Поверхность готова к культуре клеток.
3. Культуре клеток на поверхности HA Micropatterned
- Развернуть MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы и колоректального LS174T клетки карциномы, в соответствии с инструкциями производителя.
- Семенной одного клеточные суспензии раковых клеток с плотностью от 0,4 до 1x10
- Поверхности клеточной культуры может поддерживаться до 5 дней в стандартных условиях инкубатора. Изменение средств массовой информации каждый день. Морфологии клеток и рост можно наблюдать с помощью инвертированного микроскопа свет. Дополнительная сотовой анализов могут быть применены для анализа ответов на поверхности HA.
4. Представитель Результаты:
Карбодиимида химии используется для ковалентно иммобилизовать га до APTMS слайды узорчатого стекла показана на рисунке 1А. EDC является нулевой длины сшивающего агента, который реагирует с ГК карбоксильных групп с образованием амин-реактивных промежуточных продуктов. Как это промежуточное подвержен гидролизу, NHS добавляется к увеличению карбодиимида эффективности реакции. Как HA решение взаимодействует с APTMS micropatterns, стабильной амидной связью между формами HA промежуточной и основной амин ATPMS. Примером поверхности HA узорной визуализированы использованием флуоресцентного микроскопа и интенсивности флуоресценции ImageJ анализ показал, узорные иммобилизации ГК показаны (рис. 1B-C).
HA micropatterned поверхности позволяют проводить изучение взаимодействия раковых клеток с expgenous HA. Оба MDA-MB-231 молочной железы человека и LS174t линий человека рака толстой кишки ячейки преимущественно придерживаются HA micropatterned регионов (рис. 2). Высокое разрешение изображения с помощью сканирующей электронной микроскопии может быть использована для анализа взаимодействия культивируемых клеток с ГК иммобилизованных поверхности (рис. 3).
Рисунок 1 HA micropatterned поверхностей () Схема описания развития ГК функциональные поверхности, (Б) изображение флуоресценции флуоресцеина (зеленый) меченных HA micropatterned поверхности. (C) 3D пикселей распределения карте с помощью программного обеспечения ImageJ демонстрируя дискретных моделей HA. Шкала бар = 100 мкм. Измененные с 9 с разрешения Elsevier.
Рисунок 2. Рака клеточной адгезии на поверхности HA micropatterned. Оба двоеточие () и грудь (В) рак преимущественно придерживался на HA патчи с 24 часов культуры. Измененные с 9 с разрешения Elsevier.
Рисунок 3. Раковых клеток взаимодействия с ГК. (А), сканирующей электронной микроскопии изображение рака толстой кишки клетки () культивировали на поверхности HA показано при малом увеличении (слева) и большом увеличении (справа; квадратов слева) и клеток рака молочной железы (B), культивируемые на поверхности HA показано на малом увеличении (слева) и большом увеличении (справа; квадратов слева).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод HA micropatterning представлены позволяет исследования клеточных взаимодействий с экзогенными HA. HA как известно, играет ключевую роль в прогрессии рака 1, однако там были ограничены в исследованиях взаимодействия раковых клеток на двумерной поверхности HA узорные. Управляемыми исследование экзогенных micropatterns HA позволяет с высоким разрешением визуализации раковых клеток адгезии, роста и миграции и может выяснить дальнейшие основы рака.
Объединив химии карбодиимида и микроконтактной печати, мы разработали поверхности с различными модели HA для изучения взаимодействия раковых клеток. Этот метод позволяет последовательно узорной поверхности совместимы с культуре клеток и методов анализа, включая, но не ограничиваясь иммунофлуоресцентного окрашивания, сканирующей электронной микроскопии, угнетение, миграция и т.д.
Кроме того, фотолитографии методы позволяют легко микротехнологий любой желаемой модели, для контроля иммобилизации HA для конкретных приложений. Например, изготовление PDMS марок с линейными полосами бы обездвижить ГК в линейном массиве и могут быть полезны при анализе миграции клеток вдоль узорной HA.
Хотя мы в основном использовали этот метод для выяснения взаимодействия раковых клеток с ГК, этот метод применим для изучения взаимодействия с другими типами клеток. Кроме того, этот метод может быть использован для иммобилизации широкого спектра молекул ГК. HA мы иммобилизованных является флуоресцентно меченные молекулярной массой 800 кДа. Тем не менее, HA диапазонов в размере от 2000 - 25000 повторяющиеся единицы дисахарид, и клеточный ответ было продемонстрировано, чтобы зависеть от HA молекулярной массой 10-11. Этот протокол может быть применен к иммобилизации HA различного молекулярного веса для расследования клеточного ответа на экзогенные HA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Видео схема фигуры воспроизведены с разрешения; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Ко KGaA. Дикинсон LE, Kusuma S, Герехт С. Восстановление дифференциации ниш эмбриональных стволовых клеток использования биоматериалов. Макромолекул. Biosci. 2010; 21 октября. [Epub перед печатью].
Acknowledgments
Авторы признают, использование лабораторного анализа поверхности в Университете Джона Хопкинса, который финансируется в рамках наук о материалах научно-исследовательский центр через Национальный научный фонд. Светодиод IGERT обучаемого и Национального научного фонда Высшей Fellow. Работа выполнена при частичной поддержке гранта NIH U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
