Summary
외인성 hyaluronic의 산성 (HA)과 암 세포의 상호 작용의 고해상도 분석이 가능합니다 새로운 접근 방식이 설명되어 있습니다. 패턴의 표면은 carbodiimide 화학 및 microcontact 인쇄 결합하여 가공하고 있습니다.
Abstract
암 침공과 진행은 종양 microenvironment 내에서 성장 요인 / 크린 시토킨 및 세포외 매트릭스 (ECM) 구성 요소에 의해 복잡한 규제하에있는 운동성이있는 세포 표현형을 포함합니다. Hyaluronic 산 (HA)은 강화 침략, 성장 및 angiogenesis 1 종양 진행을 촉진하는 것으로 알려져 하나 stromal ECM 구성 요소입니다. HA의 상호 작용은 세포 표면 수용체 CD44는 따라서 전이성 확산 2-3 증가, 종양 세포 성장, 생존 및 마이 그 레이션을 촉진 이벤트를 신호 유도와 함께. HA는 D - glucuronic 산성 및 DN - acetylglucosamine의 단위를 반복 구성된 음이온, nonsulfated glycosaminoglycan입니다. 반복 disaccharide 단위의 카르 복실와 수산기 그룹의 존재로 인해 고유의 HA는 주로 친수성과 photoreative 고정 4-5에 대한 황산 그룹을 소개 화학 수정 의무가 있습니다. 표면에 HA의 immobilizations 관련된 이전 연구는 6-7 표면에 세포 부착을 제어하기 위해 HA의 bioresistant 행동과 그 sulfated 파생을 활용한다. 이러한 연구의 세포 접착에 우선적으로 비 HA 패턴 영역에서 발생합니다.
외인성 HA와 세포 상호 작용을 분석하기 위해, 우리는 제어 연구 및 HA와 암 세포의 상호 작용 고해상도 시각화를 활성화 패턴 기능화 표면을 개발했습니다. 우리는 유리 표면에 HA의 이산 패턴 영역을 정의하는 microcontact 인쇄 (uCP)을 활용. HA를 무력화하기 위해 carbodiimide 링크 화학을 적용 "tethering"접근 방식은 8 사용되었다. 유리 표면 microcontact aminosilane로 인쇄되었으며 패턴 배열에 HA 고정을 활성화 EDC와 NHS의 최적 비율의 HA 솔루션과 반응. MCP와 carbodiimide 화학을 포함하는 것은 체외 애플 리케이션에 적합한 표면을 생성, 정의 지역 HA의 고정을 활성화. 두 결장암 세포와 유방암 세포는 암시 HA micropatterned 표면과 상호 작용. 암 세포 접착은 48 시간의 확산과 함께 24 시간 이내에 발생했습니다. HA micropatterned 표면을 사용하여, 우리는 그 암 세포 접착은 HA 수용체 CD44을 통해 발생 보여주었다. 또한, HA 패턴의 표면 전자 현미경 (SEM)과 암 세포 접착 라고나할까요 허용된 고해상도 이미징을 검사 및 외인성 HA에 대한 암 세포의 운동성을 분석 HA 패턴에 대한 확산과 호환되었습니다.
Protocol
1. Micropatterned 스탬프 제작 표준 석판술
- 에탄올과 함께 새로운 실리콘 웨이퍼를 씻어 공기의 흐름과 건조. 웨이퍼를 처리하고 전체 과정에서 표면 결함을 방지하기 위해 집게를 사용하십시오.
- coater를 한 바퀴 돌리고 SU - 2025 부정적인 포토 레지스트와 웨이퍼 표면을 커버하기 위해 웨이퍼를 전송합니다. 포토 레지스트와 웨이퍼의 적어도 80 %를 커버. 3000rpm에서 30 초 뒤에 600rpm에서 10 초 스핀 코트. 포토 레지스트의 photosensitivity으로 인해,이 시점에서 객실 조명을 끄십시오.
- 3 분 95 ° C에서 "부드러운 빵을"에 대한 뜨거운 접시에 코팅된 실리콘 웨이퍼를 포토 레지스트 전송합니다. 핫 플레이트에서 제거하고 1 시간 냉각 수 있습니다.
- 포토 레지스트 덮인 실리콘 웨이퍼 위에 원하는 패턴으로 미리 가공 마스크를 놓고 20 초 동안 자외선 (UV) 조사 (350-450 nm의)에 노출.
- 110 "하드 베이킹"에 철판 ° 육분 위해 C로 전송 실리콘 웨이퍼.
- 불을 켜고 철판에서 웨이퍼를 제거합니다. 독특한 패턴이 시점에서 볼 수 있습니다.
- SU - 8 포토 레지스트 개발로 실리콘 웨이퍼를 주의깊게 린스. 개발자 솔루션 3 rinses 후 에탄올로 린스. 모든 백색 잔류물이 있으면, 포토 레지스트 개발 솔루션과 헹굼 반복하거나 잠수함 웨이퍼를 개발자 솔루션 2 분 헹구세요 에탄올로 다시 진행합니다. 물, 공기 건조와 함께 씻으십시오.
- 믹스 polydimethylsiloxane (PDMS) 10시 1분 무게 비율에 엘라스토머 솔루션과 치료 요원. 공기 방울을 제거하는 5 분간 900rpm에서 원심 분리기.
- 장소는 배양 접시에있는 웨이퍼 패턴과 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 잔. 몇 분 현재 거품, desicator의 장소와 진공이있다면 거품이 사라까지.
- 보완 탄성 스탬프를 형성 실내 온도 (RT)에서 하룻밤 치료. PDMS는 완전히 30 분 60 ° C에서 오븐에서 개최 12시간 후 치유되지 않을 경우.
- 조심스럽게 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 제거합니다. 원하는 크기로 도장을 절단하는 레이저 에지를 사용하십시오. 15 분간 에탄올에 Sonicate. 웨이퍼 새로운 탄성 우표를 만드는 여러 번 이용하실 수 있습니다.
2. HA의 Micropatterning
- 플라즈마 깨끗한 유리는 5 분 동안 슬라이드. 5 분 챔버와 진공로 모든 슬라이드를 놓습니다. 다음 챔버를 입력 산소의 낮은 흐름을 허용합니다. 5 분에 플라즈마 청소기를 돌립니다. 포셉를 사용하여 배양 접시에있는 플라즈마 청소기와 장소에서 제거합니다.
- 플라즈마 세정 동안 15 분 동안 에탄올의 PDMS 스탬프를 sonicate.
- 15 ML의 원심 분리기 튜브의 95% V / V 에탄올 3 - aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)의 신선한 3퍼센트 V / V 솔루션을 준비합니다. silanol를 형성 RT에서 5 분간 반응하도록 허용합니다.
- 플레이스 PDMS의 스핀 coater 척의 패턴까지 우표와 커버 APTMS 솔루션으로 표면을 패턴. 30 초 동안 3500rpm에서 Spincoat. , PDMS 스탬프만을 면을 도장 표면을 만지지 마십시오.
- 패턴 측면의 한쪽 끝을 아래로 향하게 설정 스탬프를하고 1 분 유리 표면과 접촉 완전히되도록 부드럽게 PDMS를 눌러 글라이드 : 플라즈마에 전송 APTMS 솔루션은 유리 표면을 청소.
- PDMS는 부드럽게 도장 제거하고, 패턴 유리 슬라이드 30 분 RT에서 품어 수 있습니다. 에탄올과 공기 건조와 패턴 표면을 씻어. Sonicate PDMS 초과 APTMS을 제거하는 15 분 동안 도장.
- 115에서 1 시간 동안 오븐이나 뜨거운 접시에 열 표면 ° C. 에탄올로 씻어 건조 공기.
- [메톡시 (polyethyleneoxy) 프로필] 톨루엔에 trimethoxysilane - 신선한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) - 실란 20% V / V 2 솔루션을 준비합니다. 이 패턴을 둘러싼 않은 지역 접착제 역할을합니다.
- 75에서 45 분 동안 PEG - 실란 솔루션 유리 페트리 접시와 부화 전송 패턴 유리 슬라이드 뜨거운 접시에 ° C. 톨루엔, 물, 공기와 건조와 린스.
- 생물 학적 안전 캐비닛에 UV 살균 방사선을 사용하여 1 시간 소독. 불임을 유지하기 위해이 시점에서 생물 학적 안전 캐비넷에서 진행합니다.
- 수성 멸균 HA 솔루션을 준비합니다.
1 - 에틸 -3 - (3 - 디메틸 아미노) carbodiimide (EDC)의 10mM
N - hydroxysuccinimide의 5mM
50μg / ML 플루오레신 - 분류 HA - 무균 조건에서 패턴 유리 기판에 HA 솔루션을 적용하고 빛으로부터 보호. 패턴 기판은 16-24시간 위해 그대로해야합니다.
- HA 솔루션을 기음과 씻어 인산염 버퍼 호수 (PBS), 1 시간 동안 PBS에서 (BSA) 1% 소 혈청 알부민과 표면을 커버. 표면은 이제 세포 배양을위한 준비가되었습니다.
3. HA Micropatterned 표면에 세포 배양
- 확장 MDA - MB - 231 제조 업체의 지시에 따라 인간의 유방암 세포 LS174T 대장암 암종 세포.
- 0.4과 1x10 사이의 밀도와 암 세포의 씨앗 단세포 suspensions
2 유리 면적 당 및 HA에> 6 암세포는 표면 고정화. 5 % CO 2 관리 대기 속에서 humidified 인큐베이터 (37 ° C)에서 알을 품다. 세포 접착은 24 시간 이내에 발생해야하며 거꾸로 가벼운 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다 - 세포 배양 표면은 표준 보육 조건 5 일 이내에 유지 수 있습니다. 매일 미디어를 변경합니다. 세포 형태학 및 성장은 거꾸로 광 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다. 추가 셀룰러 assays은 HA의 표면에 반응을 분석하기 위해 적용할 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
covalently APTMS 패턴 유리 슬라이드에 HA를 무력화하는 데 사용 carbodiimide 화학은 그림 1A에 표시됩니다. EDC는 아민 반응 중간체를 형성하기 위해 HA 카르 복실 그룹과 반응 길이가 0 인 crosslinking 에이전트입니다. 이 중간은 가수 분해에 감염될이므로, NHS는 carbodiimide 반응 효율을 높이는 추가됩니다. HA 솔루션은 APTMS micropatterns, HA 중급 ATPMS의 기본 아민 간의 안정적인 아미드 결합 형태와 상호 작용으로. HA 패턴 표면의 예입니다 (1B - C 그림) 표시됩니다 HA의 패턴 고정을 입증 형광 현미경과 ImageJ 형광 강도 분석을 사용하여 시각.
HA micropatterned의 표면 expgenous HA와 암 세포의 상호 작용 연구를 활성화합니다. 두 MDA - MB - 231 인간의 모유와 LS174t 인간의 결장암 세포 라인은 우선적으로 HA micropatterned 영역 (그림 2)을 준수. 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 고해상도 이미지는 HA 고정화 표면 (그림 3)과 교양 세포의 상호 작용을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1 HA micropatterned 표면 HA 기능성 표면의 발전을 설명하는 (A) 도식, 플루오레신의 (B) 형광 이미지 (녹색) 표시 HA micropatterned 표면. (C) 3D 픽셀 분포지도 이산 HA 패턴을 보여주 ImageJ 소프트웨어를 사용합니다. 스케일 바 = 100μm. Elsevier의 허가를 9 수정.
HA micropatterned 표면에 그림 2. 암 세포 접착. 콜론 (A)과 유방 모두 (B) 암종 우선적으로 문화 24 시간과 HA 패치에 준수. Elsevier의 허가를 9 수정.
HA와 그림 3. 암 세포 상호 작용. (A) 결장암 세포 낮은 배율 (왼쪽)와 높은 배율 (오른쪽, 왼쪽에있는 사각형)에서 표시 HA 표면에 (A) 교양의 전자 현미경 이미지를 검색 및 유방암 세포 (B)에서 그림 HA 표면에 교양 낮은 배율 (왼쪽)와 높은 배율 (오른쪽, 왼쪽에있는 사각형).
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Discussion
제시 HA의 micropatterning 방법은 외인성 HA와 세포 상호 작용의 연구를 수 있습니다. HA는 암 진행 1 핵심적인 역할을하는 것으로 알려져 있지만 2 차원 패턴 HA 표면에 암 세포의 상호 작용을 조사 제한된 연구가있다. 외인성 HA의 micropatterns에 대한 제어 연구는 암 세포 부착, 성장, 및 마이 그 레이션의 고해상도 시각화를 허용하고 암이 더 기초를 명료하게하다 수 있습니다.
carbodiimide 화학 및 microcontact 인쇄를 결합함으로써, 우리는 암 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 별개의 HA 패턴과 표면을 개발했습니다. 이 방법을 포함하여 세포 배양 및 분석 기술을 지속적으로 패턴 표면 호환 가능하지만, immunofluorescent 얼룩에 국한되지, 전자 현미경, 억제, 마이 그 레이션 등을 스캔
또한, photolithographic 기술을 특정 응용 프로그램을위한 HA의 고정을 제어하는 모든 원하는 패턴의 쉬운 microfabrication을 허용합니다. 예를 들어, 선형 줄무늬와 PDMS 스탬프를 fabricating 것은 선형 배열에 HA를 무력화 될 것이며 패턴 HA 따라 셀 마이 그 레이션을 분석 도움이 될 수 있습니다.
우리가 주로 HA와 암 세포 상호 작용을 명료하게하다이 방법을 활용했지만,이 기법은 다른 세포 유형과 상호 작용을 연구하기 위해 적용됩니다. 또한이 방법은 HA 분자의 광범를 무력화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 움직일 수있는 HA는 찬란 800 KDA의 분자량과 함께 표시됩니다. 그러나, HA의 2000 크기의 범위 - 25,000 disaccharide 반복 단위, 그리고 세포 응답 HA 분자 중량 10-11에 의존하는 증명되었습니다. 이 프로토콜은 따라서 외인성 HA에 세포 응답을 조사하기 위해 분자 무게 변화의 HA를 무력화하기 위해 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
허가 전재 비디오 도식 그림, 저작권 빌리 - VCH Verlag GmbH를 & 주식 KGaA. 디킨슨 LE, Kusuma S, Gerecht S.은 biomaterials를 사용하여 배아 줄기 세포의 분화의 틈새를 재구성. Macromol. Biosci. 2010; 10월 21일. [인쇄 앞서 Epub].
Acknowledgments
저자는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 통해 재료 연구 과학 및 엔지니어링 센터의 일환으로 후원 존스 홉킨스에서 표면 분석 연구실의 사용을 인정합니다. LED가 IGERT 트레이와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구원입니다. 이 연구는 부분적으로 NIH 부여 U54CA143868에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
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