Summary
Een nieuwe aanpak die de hoge-resolutie analyse van kanker cel interacties mogelijk met exogeen hyaluronzuur (HA) is beschreven. Oppervlakken met een patroon zijn vervaardigd door het combineren van carbodiimide chemie en microcontact afdrukken.
Abstract
Kanker invasie en de progressie gaat om een beweeglijke cel fenotype, die onder complexe regulatie door groeifactoren / cytokinen en extracellulaire matrix (ECM) componenten binnen de tumor micro-omgeving. Hyaluronzuur (HA) is een stromale ECM component waarvan bekend is dat tot tumorprogressie te vergemakkelijken door het verbeteren van invasie, de groei, en angiogenese 1. Interactie van HA met het celoppervlak receptor CD44 leidt tot signalering gebeurtenissen die de groei van tumorcellen, de overleving en migratie te bevorderen, waardoor metastatische verspreiding 2-3. HA is een anionische, nonsulfated glycosaminoglycaan bestaat uit repeterende eenheden van D-glucuronzuur en DN-acetylglucosamine. Door de aanwezigheid van de carboxyl-en hydroxylgroepen herhalen disacharide-eenheden, native HA is grotendeels hydrofiel en vatbaar voor chemische modificaties die sulfaat groepen voor photoreative immobilisatie 4-5 te introduceren. Eerdere studies met betrekking tot de immobilizations van HA op oppervlakken gebruik maken van de bioresistant gedrag van HA en de gesulfateerde afgeleide naar celadhesie controle op oppervlakken 6-7. In deze studies celadhesie bij voorkeur gebeurt op non-HA patroon regio's.
Voor het analyseren van cellulaire interacties met exogene HA, hebben we een patroon gefunctionaliseerde oppervlakken die een controleerbare studie en hoge-resolutie visualisatie van kanker cel interacties met HA mogelijk te maken. Gebruikten we microcontact printen (UCP) naar discrete patroon regio's van HA te definiëren op een glazen ondergrond. Een "tethering" aanpak die carbodiimide het koppelen van de chemie is van toepassing op immobiliseren HA werd gebruikt 8. Glazen oppervlakken werden microcontact bedrukt met een aminosilaan en reageerde met een HA-oplossing van optimale verhoudingen van EDC en de NHS naar HA immobilisatie inschakelen in patroon arrays. Integratie van carbodiimide chemie met MCP kon de immobilisatie van HA aan bepaalde regio's, het creëren van oppervlakken die geschikt zijn voor in-vitro-toepassingen. Beide dikke darm kankercellen en cellen van borstkanker impliciet interactie met de HA micropatterned oppervlakken. Kankercel hechting opgetreden binnen 24 uur met proliferatie door 48 uur. Met behulp van HA micropatterned oppervlakken, hebben we aangetoond dat kanker celadhesie vindt plaats via de HA-receptor CD44. Bovendien, HA oppervlakken met een patroon verenigbaar waren met de scanning electron microscopy (SEM) en liet een hoge resolutie beeldvorming van kankercellen lijm uitsteeksels en het verspreiden van HA patronen om kanker te celbeweeglijkheid analyseren op exogene HA.
Protocol
1. Standaard Fotolithografie voor micropatterned Stamp Fabrication
- Spoel een nieuwe silicium wafer met ethanol en droog met een stroom van lucht. Gebruik een tang om wafer hanteren en oppervlaktebeschadigingen te voorkomen tijdens het gehele proces.
- Overdracht wafer te coater draaien en oppervlak van een wafer te bedekken met SU-2025 negatief fotolak. Ten minste 80% van de wafer met fotolak. Spin jas 10 seconden bij 600rpm, gevolgd door 30 seconden bij 3000rpm. Vanwege de lichtgevoeligheid van de fotoresist, uit te schakelen zaal lichten vanaf dit punt naar voren.
- Overdracht fotolak gecoat silicium wafer te hete plaat voor "soft-bakken" bij 95 ° C gedurende 3 minuten. Verwijderen van hete plaat en laat 1 minuut afkoelen.
- Plaats een geprefabriceerde masker met het gewenste patroon op de top van de fotoresist bedekte silicium wafer en blootstellen aan ultraviolet (UV) straling (350-450 nm) gedurende 20 seconden.
- Overdracht silicium wafer te hete plaat voor "hard-bakken 'op 110 ° C gedurende 6 minuten.
- Zet de lichten en te verwijderen wafer van hete plaat. Duidelijke patronen zichtbaar moet zijn op dit punt.
- Zorgvuldig na te spoelen silicium wafer met SU-8 fotolak ontwikkelaar. Na 3 spoelingen met ontwikkelaar oplossing, spoelen met ethanol. Als er een wit residu aanwezig is, herhaalt u spoelen met fotolak ontwikkelaar oplossing, of gewoon onderdompelen in de wafer ontwikkelaar oplossing gedurende 2 minuten en ga weer met ethanol te spoelen. Wassen met water en lucht drogen.
- Mix polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer oplossing en verharder in een 10:01 gewichtsverhouding. Centrifugeer bij 900rpm gedurende 5 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Plaats patroon wafer in Petri schaal en giet PDMS op silicium wafer. Als er luchtbellen aanwezig zijn, plaats in de desicator en vacuüm voor een paar minuten tot de belletjes verdwijnen.
- Cure 's nachts bij kamertemperatuur (RT) om een aanvullende elastomeer stempel te vormen. Als PDMS is niet volledig uitgehard na 12 uur, plaats in de oven op 60 ° C gedurende 30 minuten.
- Verwijder voorzichtig PDMS van silicium wafer. Gebruik een scheermes rand aan stempel op de gewenste grootte. Sonificeer in ethanol gedurende 15 minuten. Wafeltjes kan worden gebruikt meerdere keren om nieuwe elastomeer postzegels te creëren.
2. HA Micropatterning
- Plasma schoon glas dia's voor 5 minuten. Plaats alle dia's in de kamer en vacuüm gedurende 5 minuten. Laat vervolgens weinig toevoer van zuurstof naar kamer te gaan. Zet plasma reiniger op voor 5 minuten. Verwijderen uit het plasma schoner en plaats in een petrischaal met behulp van een tang.
- Tijdens het plasma reiniging, ultrasone trillingen PDMS postzegels in ethanol gedurende 15 minuten.
- Bereid een verse 3% v / v oplossing van 3-aminopropyltrimethoxysilaan (APTMS) in 95% v / v ethanol in een 15 ml centrifugebuis. Laat om te reageren gedurende 5 minuten bij RT een silanol te vormen.
- Plaats PDMS stempel patroon-up op de spin coater boorkop en bedek patroon oppervlak met APTMS oplossing. Spincoat op 3500rpm gedurende 30 seconden. Raak het stempel oppervlak, alleen de zijkanten van PDMS stempel.
- Overdracht APTMS oplossing voor de plasma gereinigde glazen oppervlakken: set stempel naar beneden aan het ene uiteinde van de patroon kant en voorzichtig glijden drukken PDMS dus het is volledig in contact met glas oppervlak voor 1 minuut.
- Verwijder PDMS zacht stempel, en laat patroon glaasje in RT incubeer gedurende 30 minuten. Spoel oppervlakken met een patroon met ethanol en drogen. Sonificeer PDMS stempel gedurende 15 minuten om overtollig APTMS te verwijderen.
- Warmte oppervlakken in de oven of op de hete plaat gedurende 1 uur bij 115 ° C. Spoel af met ethanol en droog met lucht.
- Bereid verse polyethyleenglycol (PEG)-silaan oplossing van 20% v / v 2 - [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilaan in tolueen. Dit zal dienen als een niet-klevende gebied rond patronen.
- Overdracht figuurglas dia naar een glazen petrischaal en incubeer in PEG-silaan-oplossing gedurende 45 minuten bij 75 ° C op een hete plaat. Spoelen met tolueen, water en droog met lucht.
- Steriliseer gedurende 1 uur met behulp van UV-bestraling kiemdodende in een biologisch veiligheidskabinet. Ga in biologische veiligheidskabinet vanaf dit punt naar voren om de steriliteit te behouden.
- Bereid waterige steriele HA-oplossing.
10mm 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)
5 mm van N-hydroxysuccinimide
50 microgram / ml fluoresceïne-gelabelde HA - Van toepassing HA oplossing voor de figuurglas substraten in steriele omstandigheden en beschermd tegen licht. Patroon ondergronden moeten ongestoord gedurende 16-24 uur.
- Aspireren uit HA-oplossing, wassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), en het oppervlak met 1% bovine serum albumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur te dekken. Het oppervlak is nu klaar voor celcultuur.
3. Cel Cultuur op HA micropatterned oppervlakken
- Uit te breiden MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen en LS174T colorectale carcinoom cellen, volgens de instructies van de fabrikant.
- Seed enkele cel suspensies van kankercellen met dichtheden tussen de 0,4 en 1x10
- Celcultuur oppervlakken kan worden gehandhaafd tot 5 dagen in standaard incubator omstandigheden. Verandering media om de andere dag. Celmorfologie en groei kan worden waargenomen met behulp van omgekeerde lichtmicroscoop. Extra cellulaire testen kunnen worden toegepast om antwoorden te analyseren aan de HA oppervlakte.
4. Representatieve resultaten:
De carbodiimide chemie gebruikt om covalent te immobiliseren HA om APTMS figuurglas dia's is weergegeven in figuur 1A. EDC is een lengte nul vernettingsmiddel die reageert met HA carboxylgroepen te vormen amine-reactieve tussenproducten. Omdat dit tussenproduct is gevoelig voor hydrolyse, wordt toegevoegd aan de NHS carbodiimide reactie efficiëntie te verhogen. Als HA-oplossing interageert met APTMS micropatterns, een stabiele amidebinding vormen tussen de HA intermediaire en primaire amine van ATPMS. Een voorbeeld van HA patroon oppervlak gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop en een ImageJ fluorescentie-intensiteit de analyse van de patroon immobilisatie van HA aan te tonen worden weergegeven (Figuur 1B-C).
De HA micropatterned oppervlakken kan de studie van kanker cel interacties met expgenous HA. Zowel MDA-MB-231 menselijke borst-en darmkanker LS174t menselijke cellijnen bij voorkeur zich te houden aan HA micropatterned regio's (figuur 2). Hoge resolutie beeldvorming met behulp van scanning elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om interacties van gekweekte cellen met HA geïmmobiliseerd oppervlakken (figuur 3) te analyseren.
Figuur 1 HA micropatterned oppervlakken (A) Schematische beschrijving van de ontwikkeling van HA functionele oppervlakken, (B) fluorescentie beeld van fluoresceïne (groen)-gelabelde HA micropatterned oppervlak. (C) 3D pixel distributie kaart met behulp van software ImageJ het aantonen van de discrete HA patronen. Schaalbalk = 100 urn. Gewijzigd ten opzichte van 9 met toestemming van Elsevier.
Figuur 2. Cancer cellen hechting op HA micropatterned oppervlakken. Zowel de dubbele punt (A) en borst (B) carcinoom bij voorkeur gehecht aan HA patches met 24 uur van de cultuur. Gewijzigd ten opzichte van 9 met toestemming van Elsevier.
Figuur 3. Cancer cel interactie met de HA. (A) Scanning electronen microscopie beelden van de dikke darm kankercellen (A) gekweekt op HA oppervlakken getoond bij een lage vergroting (links) en een sterke vergroting (rechts; van de vierkanten op links) en van borstkankercellen (B) gekweekt op HA oppervlakken getoond bij een lage vergroting (links) en een sterke vergroting (rechts; van de vierkanten op links).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De HA gepresenteerde micropatterning methode maakt het mogelijk de studie van de cel interacties met exogeen HA. HA is bekend dat een belangrijke rol spelen in de progressie van kanker een maar er zijn beperkte studies naar de interactie van kankercellen op twee dimensionale HA oppervlakken met een patroon. Een bestuurbare studie over de exogene HA micropatterns maakt hoge-resolutie visualisatie van kanker celadhesie, groei en migratie en kan verhelderen verder fundamenten van kanker.
Door het combineren van carbodiimide chemie en microcontact drukken, hebben we oppervlakken met verschillende HA patronen aan kanker cel interacties te bestuderen. Deze methode maakt het consistent patroon oppervlakken compatibel met celkweek en analyse technieken, waaronder, maar niet beperkt tot immunofluorescentie vlekken, scanning elektronenmicroscopie, inhibitie, migratie, enz.
Daarnaast fotolithografische technieken laten toe de gemakkelijke microfabricage van elk gewenst patroon, tot immobilisatie van HA voor specifieke toepassingen te controleren. Bijvoorbeeld, het vervaardigen van PDMS postzegels met lineaire strepen immobiliseren HA in een lineaire reeks en zou nuttig kunnen zijn bij het analyseren van celmigratie langs patroon HA.
Hoewel we in de eerste plaats gebruikt deze methode om kanker cel interacties verhelderen met HA, deze techniek is van toepassing op interactie met andere celtypen te bestuderen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om een breed scala van HA moleculen te immobiliseren. De HA we hebben geïmmobiliseerd is fluorescent gelabelde met een molecuulgewicht van 800 kDa. Echter, HA varieert in grootte van 2000 - is 25.000 herhalen disacharide-eenheden, en de cellulaire respons is aangetoond afhankelijk te zijn van HA moleculair gewicht 10-11. Dit protocol kan dan ook worden toegepast op de HA van verschillende molecuulgewichten naar cel respons op exogene HA onderzoeken immobiliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Video schematische figuur gereproduceerd met toestemming; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, gerecht S. Reconstructie van de differentiatie niche van embryonale stamcellen met behulp van biomaterialen. Macromol. Biosci. 2010, 21 oktober. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
De auteurs erkennen het gebruik van de oppervlakte-analyse laboratorium aan de Johns Hopkins, gefinancierd in het kader van het Materials Science and Engineering Research Center door middel van de National Science Foundation. LED is een IGERT stagiair en een National Science Foundation Graduate Fellow. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
