Summary
Eksojen hyaluronik asit (HA) ile yüksek çözünürlüklü kanser hücre etkileşimleri analiz olanak sağlayan yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Desenli yüzeyleri carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek imal edilir.
Abstract
Kanser işgali ve ilerlemesi tümör mikroçevresinin içinde büyüme faktörleri / sitokinler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri karmaşık düzenleme altında bir hareketli hücre fenotipi içerir. Hyaluronik asit (HA), artırılması işgali, büyüme ve anjiyogenez 1 tümör ilerlemesini kolaylaştırmak için bilinen bir stromal ECM bileşeni . Etkileşim HA hücre yüzey reseptörü CD44, tümör hücre büyümesini, hayatta kalma ve göç teşvik olaylar böylece metastatik yayılmasını 2-3 artan sinyalizasyon neden olur. HA, D-glukuronik asit ve DN-asetilglukozamin birimleri tekrar oluşan bir anyonik, nonsulfated glikozaminoglikan. Tekrarlayan disakkarit ünitelerinde karboksil ve hidroksil grupları, varlığı nedeniyle doğal HA büyük ölçüde hidrofilik ve sülfat photoreative immobilizasyon 4-5 grupları tanıtmak kimyasal değişiklikler için uygun. Önceki çalışmalar yüzeyler üzerine HA immobilizations içeren 6-7 yüzeylerinden hücre yapışmasını kontrol etmek HA bioresistant davranış ve sülfatlanmış türevi kullanmaktadır. Tercihen bu çalışmalar hücre adezyon-HA olmayan desenli bölgelerde oluşur.
Ekzojen HA ile hücresel etkileşimleri analiz etmek, kontrol edilebilir bir çalışma ve HA ile kanser hücre etkileşimleri yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlayan desenli Fonksiyonlu yüzeyler geliştirdiler. Biz cam yüzeyler üzerinde HA ayrık desenli bölgeleri tanımlamak için kullanılan microcontact baskı (UCP). HA hareketsiz carbodiimide bağlayan kimya uygulanan "bağlama" yaklaşımı 8 kullanıldı. Cam yüzeyler microcontact aminosilane ile basıldı ve EDC ve NHS desenli dizileri HA immobilizasyon sağlamak için optimize edilmiş oranları HA çözüm tepki gösterdi. Carbodiimide kimya MCP ile ekleme in vitro uygulamaları için uygun yüzeyler oluşturmak, tanımlanmış bölgelere HA immobilizasyon etkin. Her iki kolon kanseri hücreleri ve meme kanseri hücrelerinin dolaylı HA micropatterned yüzeyler ile etkileşim. Kanser hücre adezyon proliferasyonu ile 24 saat içinde 48 saat oluştu. HA micropatterned yüzeyler kullanarak, kanser hücre adezyon HA reseptörü CD44 üzerinden gerçekleşir gösterdi. Ayrıca, HA desenli yüzeyler, tarama elektron mikroskobu (SEM) ve kanser hücresi yapışkan çıkıntılar izin verilen yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve kanser hücre hareketi analiz etmek için ekzojen HA HA desen yayılan ile uyumlu idi.
Protocol
1. Micropatterned Damga Fabrikasyon Standart Fotolitografi
- Etanol ile yeni bir silikon yonga hava akışı ile durulayın ve kurulayın. Gofret ele almak ve tüm süreç boyunca yüzey hasarları önlemek için forseps kullanın.
- Lak spin ve SU-2025 negatif fotorezist gofret yüzeyini kaplayan gofret aktarın. Paslanmaz çeliğin en az% 80 gofret örtün. 3000rpm 30 saniye takip 600rpm az 10 saniye süreyle Spin kat. Fotorezist fotosensitivite nedeniyle, bu noktadan itibaren oda ışıkları kapatın.
- 95 ° C'de 3 dakika boyunca "yumuşak fırında" sıcak levha kaplamalı silikon gofret fotorezist aktarın. Sıcak levha çıkar ve 1 dakika soğumasını bekleyin.
- Fotorezist kaplı silikon gofret üstüne istenilen desen prefabriklerin maske koyun ve 20 saniye için ultraviyole (UV) ışınları (350-450 nm) maruz bırakmayın.
- Sıcak levha "sabit fırında" için 110 ° C 6 dakika Transfer silikon gofret.
- Işıkları açın ve sıcak plaka gofret kaldırmak. Farklı desenleri bu noktada görünür olmalıdır.
- SU-8 fotorezist geliştirici ile silikon gofret dikkatlice yıkayın. 3 geliştirici çözümü ile çalkalama sonra, etanol ile yıkayın. Herhangi bir beyaz kalıntı varsa, paslanmaz çeliğin geliştirici çözümü ile durulayın tekrar, ya da sadece batığın gofret geliştirici çözüm ve 2 dakika süreyle yıkayın etanol ile tekrar devam edebilir. Su ve kuru hava ile yıkayın.
- Mix polidimetilsiloksan (PDMS) 10:1 ağırlık oranı elastomer çözüm ve sertleştirici. Hava kabarcıklarını çıkarmak için 5 dakika için 900 RPM santrifüjleyin.
- Place Petri kabındaki gofret desenli PDMS ve silikon yonga üzerine dökün. Birkaç dakika için mevcut kabarcıkları, desicator yer ve vakum varsa kabarcıkları kayboluncaya kadar.
- Tamamlayıcı bir elastomerik damgası oluşturmak için oda sıcaklığında (RT) bir gecede kurtulun. PDMS tamamen 60 ° C'de 30 dakika fırında, yerde 12 saat, sonra tedavi değil ise.
- Dikkatle silikon gofret PDMS çıkarın. Istediğiniz boyuta damga kesmek için bıçak kenar kullanın. 15 dakika boyunca etanol içinde sonikasyon. Gofret yeni elastomerik pullar oluşturmak için birden fazla kez kullanılabilir.
2. HA Micropatterning
- Plazma temiz bir cam, 5 dakika boyunca slaytlar. 5 dakika boyunca oda ve vakum tüm slaytlara yerleştirin. Sonra odasına girmek için düşük oksijen akışına izin verir. 5 dakika boyunca plazma temizleyici açın. Plazma temizleyici ve forseps kullanarak bir Petri kabındaki yerden çıkarın.
- Plazma temizlik sırasında, 15 dakika boyunca etanol PDMS pulları sonikasyon.
- 15 ml santrifüj tüpüne% 95 v / v etanol 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) taze% 3 v / v çözüm hazırlayın. Tepki silanolle formu RT az 5 dakika izin ver.
- Yeri PDMS damga dönmeye coater Chuck desen ve kapak yüzeyi desenli APTMS çözüm. 30 saniye için 3500 Spincoat. PDMS damga, sadece iki tarafın damga yüzeyine dokunmayın.
- Desenli yan bir ucunu aşağı bakacak şekilde set mühür ve 1 dakika için cam yüzeyi ile temas halinde tamamen yavaşça PDMS basarak kayma: Transfer plazma APTMS çözüm cam yüzeyler temizlenmelidir.
- PDMS hafifçe damga çıkarın ve buzlu cam slayt RT 30 dakika boyunca inkübe izin. Desenli yüzeyler etanol ve kuru hava ile durulayın. Sonikasyon PDMS aşırı APTMS kaldırmak için 15 dakika boyunca damgası.
- 115 1 saat fırında veya sıcak plaka üzerinde Isı yüzeyler ° C Etanol ile çalkalayın ve kuru hava ile.
- [Metoksi (polyethyleneoxy) propil] toluende trimethoxysilane - taze polietilen glikol (PEG) silan% 20 v / v 2 çözüm hazırlayın. Bu desen çevreleyen yapışkan olmayan bir bölge olarak hizmet verecek.
- 75 az 45 dakika boyunca bir bardak PEG-silan çözüm Petri kabı ve inkübe Transfer buzlu cam slayt ° C sıcak bir plaka. Toluen, su ve hava ile kuru ile durulayın.
- Biyolojik güvenlik kabini UV antiseptik ışınlama kullanarak 1 saat süreyle sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabini kısırlık korumak için bu noktadan devam edin.
- Sulu steril HA çözeltisi hazırlayın.
1-Etil-3-(3-Gaz sistemlerinde) carbodiimide (EDC), 10mM
N-hydroxysuccinimide, 5mM
50μg / ml flöresein etiketli HA - Steril koşullar HA çözüm buzlu cam yüzeye uygulayın ve ışıktan korunmalıdır. Desenli yüzeylerde 16-24 saat boyunca rahatsız olmalıdır.
- HA kapalı aspire çözüm, bol suyla yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS), ve 1 saat süreyle PBS (BSA)% 1 sığır serum albümini ile yüzeyini kaplayacak. Yüzeyi hücre kültürü için hazırdır.
3. HA Micropatterned Yüzeylerde Hücre Kültürü
- Expand MDA-MB-231 üreticinin talimatlarına göre insan meme kanseri hücreleri ve LS174T kolorektal karsinom hücreleri.
- 0.4 ve 1x10 arasındaki yoğunlukları ile kanser hücrelerinin Tohum tek hücre süspansiyonları
- Hücre kültürü yüzeyleri standart inkübatör koşullarında 5 gün kadar muhafaza edilebilir. Her gün medya değiştirin. Hücre morfolojisi ve büyüme ters ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Ek hücre deneyleri HA yüzeye yanıtları analiz etmek için uygulanabilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Kovalent APTMS buzlu cam slaytlara HA hareketsiz kullanılan carbodiimide kimya Şekil 1A gösterilmiştir. EDC HA karboksil grupları ile reaksiyona girer amin-reaktif ara oluşturmak için sıfır uzunlukta bir çapraz bağlanma ajandır. Bu ara hidroliz duyarlı olarak, NHS carbodiimide reaksiyon verimi artırmak için eklenir. HA çözüm APTMS micropatterns, HA ATPMS, orta ve primer amin arasında istikrarlı bir amid bağı formları ile etkileşim. HA desenli yüzeyinin bir örnek gösterilmiştir (Şekil 1B-C) bir floresan mikroskop ve bir ImageJ floresan analizi kullanarak HA desenli immobilizasyon göstermek görüntülendi.
HA micropatterned yüzeyler expgenous HA ile kanser hücre etkileşimleri çalışma sağlar. Her ikisi de MDA-MB-231 insan meme ve LS174t insan kolon kanseri hücre dizilerinde tercihen HA micropatterned bölgeleri (Şekil 2) için uygun. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme HA hareketsiz yüzeyler (Şekil 3) ile kültür hücreleri etkileşimlerini analiz etmek için kullanılabilir.
Şekil 1 HA micropatterned yüzeyler anlatan HA fonksiyonel yüzeyler geliştirme (A) Şematik, (B) floresein floresan (yeşil) etiketli HA micropatterned yüzey. (C) 3D piksel dağılım haritası ayrık HA desen gösteren ImageJ yazılımı kullanarak. Ölçek çubuğu = 100μm. Elsevier izin 9 - Modifiye.
Şekil 2 HA micropatterned yüzeylerde Kanser hücre adezyon. Kolon (A) ve meme Her ikisi de (B) karsinom tercihen 24 saat kültür ile HA yamaları üzerine yapıştırılır. Elsevier izin 9 - Modifiye.
Şekil 3 HA ile Kanser hücrelerinin etkileşimi. (A), kolon kanseri hücrelerinin HA yüzeylerde düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütmede (sağ, sol tarafta kareler) gösterilen (A) kültürlü elektron mikroskobu görüntüleri, meme kanseri hücrelerinin Tarama ve (B) gösterilen HA yüzeylerinin kültüre düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütmede (sağ, sol tarafta kareler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekzojen HA HA micropatterning yöntemi ile hücre etkileşimleri çalışma sağlar. HA 1 kanserinin ilerlemesini önemli bir rol oynadığı bilinmektedir ancak iki boyutlu HA desenli yüzeyler üzerinde kanser hücrelerinin etkileşimi araştıran sınırlı sayıda çalışma yapılmış ve yapılmaktadır . Ekzojen HA micropatterns denetlenebilir bir çalışmada, kanser hücre adezyon, büyüme, göç ve yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar ve kanser daha fazla temellerini aydınlatmak olabilir.
Carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek, kanser hücre etkileşimleri çalışmak için farklı HA desenleri ile yüzeyler geliştirdiler. Bu yöntem sürekli desenli yüzeyler de dahil olmak üzere hücre kültürü ve analiz teknikleri ile uyumlu izin verir, ama immunofluorescent boyama ile sınırlı değil, taramalı elektron mikroskobu, inhibisyon, göç, vb.
Ayrıca, fotolitografik teknikleri, özel uygulamalar için immobilizasyon HA kontrol, istenen herhangi bir desen kolay mikroimalat izin verir. Örneğin, doğrusal bir dizi doğrusal çizgili PDMS pulları imalatı HA hareketsiz ve desenli HA boyunca hücre göçü analiz yararlı olabilir.
HA ile kanser hücre etkileşimleri aydınlatmak için öncelikle bu yöntemi kullanılmıştır olmasına rağmen, bu tekniğin diğer hücre tipleri ile etkileşimleri çalışmak için geçerlidir. Ayrıca, bu yöntem HA moleküllerin geniş bir yelpazede hareketsiz kullanılabilir. Immobilize HA 800 kDa moleküler ağırlığı ile floresan etiketlenir. Ancak, HA, 2000 yılından itibaren boyut aralıkları - 25000 yinelenen disakkarit üniteleri ve hücresel yanıt HA molekül ağırlığı 10-11 bağımlı olarak kanıtlanmıştır . Bu protokol, bu nedenle, ekzojen HA hücre yanıtını araştırmak için moleküler ağırlıkları değişen HA hareketsiz uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Izni ile çoğaltılabilir video şematik figür; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. biyomateryalleri kullanılarak embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması niş Yeniden. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı aracılığıyla Malzeme Araştırma Bilimi ve Mühendisliği Merkezi parçası olarak finanse, Johns Hopkins, yüzey analizi laboratuvarı kullanımı kabul etmiş sayılırsınız. LED IGERT stajyer ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Üyesi. Bu araştırma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe U54CA143868 tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
- Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
- Hamilton, S. R. The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells. Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).
- Götte, M., Yip, G. W. Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective. Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).
- Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response. Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).
- Barbucci, R. Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule. Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).
- Morra, M., Cassinelli, C. Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).
- Khademhosseini, A. Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures. Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).
- Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells. Biomaterials. 28, 825-835 (2007).
- Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid. Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).
- Gao, F. Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis. Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).
- Slevin, M. Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways. Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).
